Dette er første artikel i en serie på tre om NMR-spektroskopiens udvikling. Artikel 2 og 3 bliver bragt i Dansk Kemi nr. 10 og 11. Fra et epokegørende fysisk fænomen til et alsidigt videnskabeligt værktøj.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 9, 2015 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af Jens Jørgen Led*, Kemisk Institut, Københavns Universitet
NMR-spektroskopi, eller kerne magnetisk resonansspektroskopi, har gennem de sidste 70 år udviklet sig fra at være et epokegørende fysisk fænomen, som kun fysikere var interesseret i, til at være et alsidigt videnskabeligt værktøj. Den er i dag et af de væsentligste værtøjer inden for den analytiske kemi og en værdifuld metode til studier af dynamiske og kinetiske fænomener, herunder protonudvekslinger og elektronoverførende processer og proteiners dynamiske forhold. Hertil kommer, at NMR-spektroskopien er en udbredt teknik inden for strukturbiologi, som kan måle sig med, og supplere røntgenkrystallografien, foruden at den er en rutinemæssig metode til billeddannelse inden for diagnostisk radiologi. Endelig er den en velegnet fremgangsmåde til at studere metaboliske funktioner i levende celler og en væsentlig metode inden for materialeforskning.
Jeg skal her, i en serie på tre artikler, kort beskrive NMR-spektroskopiens baggrund og dens indførelse i Danmark, nærmere betegnet ved Kemisk Institut, Københavns Universitet, og illustrere dens anvendelse og udvikling til studier af bio-makromolekyler med eksempler fra den forskning, jeg og min gruppe, Protein-NMR Gruppen, har udført samme sted. Artiklerne her bygger i væsentlig grad på et foredrag, jeg holdt over emnet i Kemisk Forening den 23. marts 2015.
I den relativt korte beskrivelse af NMR-spektroskopiens udvikling vil det ikke være muligt at give en detaljeret gennemgang af de enkelte områder, som NMR-spektroskopien har fundet anvendelse inden for.
NMR-spektroskopiens fødsel
En given grundstofisotop, hvis atomkerne har et magnetisk moment, absorberer energi ved en ganske bestemt radiofrekvens (resonansfrekvens), når isotopen befinder sig i et magnetfelt (Bo-feltet). Dette fænomen, der kaldes det kernemagnetiske resonansfænomen, blev første gang observeret i 1946 af Felix Bloch og en række andre fysikere [1,2], som alle havde en baggrund i udviklingen af radarteknikken under 2. verdenskrig. Opdagelsen førte til, at Felix Bloch og Edward Purcell, figur 1, sammen fik Nobelprisen i fysik i 1952.
Imidlertid mente de fleste fysikere på det tidspunkt, at resonansfrekvensen var en fundamental konstant, der var karakteristisk for den pågældende grundstofisotop. Det kom derfor som en stor overraskelse, da det blev påvist, at 14N-kernerne i ammoniumnitrat har to forskellige resonansfrekvenser [3]. Resonansfrekvensen er således ikke en fundamental ”konstant”, men er givet ved:
hvor ref er referencesignalets frekvens. Mange fysikere kunne imidlertid ikke forestille sig, at de kemiske omgivelser i et molekyle kunne give anledning til en sådan ændring af resonansfrekvensen, og de mente, at der måtte være tale om en fejl. Så de mistede interessen.
Det gjorde nogle visionære kemikere derimod ikke. De indså hurtigt det enorme analytiske og identifikationsmæssige potentiale, der lå i NMR-teknikken på grund af sammenhængen mellem chemical shift og de kemiske omgivelser. For at kunne se de meget små chemical shift-ændringer var det nødvendigt med et magnetfelt, der var tilstrækkeligt homogent. Samtidig skulle det være homogent over et tilstrækkeligt stort volumen, da der på grund af NMR-teknikkens ringe følsomhed skulle anvendes relativt store stofmængder. Et sådant magnetfelt kunne firmaet Varian Associates i Silicon Valley levere.
Firmaet blev grundlagt af de to amerikanske ingeniører, brødrene Russell og Sigurd Varian i 1948. Det havde som hovedformål at fremstille klystroner, som er strålingskilden i radaranlæg, og som de to brødre havde opfundet, mens de under 2. verdenskrig deltog i radarprojektet. Varian-brødrene var dog også interesseret i nuclear magnetic resonance-teknikken og udviklede de første kommercielle NMR-spektrometre, hvoraf spektrometret Varian A-60 blev en stor succes til analytisk kemiske formål. Dette skyldtes ikke mindst, at Varian havde oprettet et “Application Lab” og blandt andet ansat den visionære kemiker Jim Shoolery.
Introduktionen af NMR-spektroskopien i Danmark
Det første NMR-spektrometer i Danmark var et Varian A-60 spektrometer, figur 2, til optagelse af 1H NMR-spektre med protonreferencefrekvens, ref, på 60 MHz. Det blev installeret på Københavns Universitets Kemiske Institut, ved det, der dengang hed Kemisk Laboratorium V. Det skete i begyndelsen af 1960’erne på initiativ af professor Børge Bak, figur 3.
Børge Baks interesseområde var spektroskopien og især mikrobølgespektroskopien, som han var en internationalt kendt pioner inden for. I den forbindelse havde han i 1950’erne besøgt Varian Associate for at skaffe klystroner, som også blev brugt som strålingskilde i mikrobølgespektrometre. Her traf han Jim Shoolery, som overbeviste ham om NMR-spektroskopiens store potentiale inden for den analytiske kemi. Med det nye Varian A-60 spektrometer fik Børge Bak og hans medarbejdere hurtigt optaget en samling 1H NMR-spektre af knap 100 af de mest almindelige organiske forbindelser – en samling, der kom til at indgå som en væsentlig del af det øvelseskursus i spektroskopi, som Instituttet gennemførte de følgende ca. 40 år, og som de fleste studerende fra Kemisk Institut sikkert husker, da kurset var en obligatorisk del af 1. dels-uddannelsen (i dag bachelor-uddannelsen).
NMR-spektroskopien blev hurtigt en udbredt teknik – også ved andre forskningsinstitutioner, idet den i vid udstrækning erstattede den våde kemi til identifikation af organiske forbindelser. Endvidere blev teknikken forbedret ved at øge magnetfeltstyrken, hvorved ikke blot spredningen af spektrets signaler øges (jf. ligning 1og 2) men også spetrometrets følsomhed, som er givet ved S/N (B0)3/2, hvor S og N er intensiteten af hhv. signal og støj.
Omkring 1967 blev Varian HA-100 NMR-spektrometret installeret ved Kemisk Laboratorium V, figur 4. Det blev finansieret af Universitetets egne forskningsmidler og kostede godt 600.000 kr., hvad der dengang svarede til 15-20 videnskabelige medarbejderes årsløn – en finansiering, der ville være ganske utænkelig i dag.
Med en referencefrekvens for protoner på 100 MHz, svarende til en magnetfeltstyrke på ca. 23.5 kGauss (2.35 Tesla) var grænsen for styrken af en elektromagnet med jernkerne nået, og andre teknikker måtte tages i brug for at forøge dispersionen og signal/støj-forholdet.
Det første kvantespring: Puls-Fourier Transformations-teknikken
Det første kvantespring i udviklingen af NMR-spektroskopien var indførelsen af Puls-Fourier Transformation (Puls-FT)-teknikken i 1966, som Richard R. Ernst og Wes A. Anderson udviklede, mens de var ansat hos Varian. Kombineret med multiscan-teknikken betød den en dramatisk forøgelse af S/N-forholdet [4]. Indtil da havde man benyttet continuous wave (cw)-teknikken, hvor man i løbet af ca. 100 sek. varierer frekvensen af et svagt radiofrekvensfelt (RF-felt) inden for det protonfrekvensområde, som kernernes resonansfrekvenser dækker. Ved de magnetfeltstyrker (B0-felter), der anvendes i praksis, svarer dette område til 1.000-2.000 Hz, inden for hvilket man vil observere et signal, hver gang resonansbetingelsen er opfyldt. Af tekniske grunde var det som oftest B0-feltet, der blev varieret (felt sweep), og RF-frekvensen, der blev holdt fast. Ved Puls-FT-teknikken derimod exciteres alle signaler samtidigt ved hjælp af en enkelt kraftig RF-puls. Det tidsafhængige henfald af kernernes magnetisering (FID = Free Induction Decay), som ekscitationen resulterer i, vil ved en Fouriertransformation give spektret. Da hele Puls-FT-processen tager omkring 1 sek., kan man i princippet optage spektret 1.000 gange inden for samme tidsrum, som det tager at optage et enkelt cw-spektrum og ved at addere de enkelte Puls-FT-spektre kan man i princippet forøge S/N-forholdet og dermed følsomheden med en faktor (1.000)1/2 30.
Fremkomsten af kraftigere magnetfelter frembragt ved hjælp af superledende elektromagneter førte til yderligere forbedring af den spektrale dispersion og spektrometrenes følsomhed. Det første spektrometer med en superledende magnet i Danmark, blev installeret på Kemisk Laboratorium V, Københavns Universitet. Det var et Bruker HX-270 spektrometer, figur 5, med en proton referencefrekvens på 270 MHz svarende til en magnetfeltstyrke på ca. 63.4 kGauss (6.34 Tesla). Spektrometret blev finansieret af Statens Naturvidenskabelige Forskningsråd og var det første spektrometer, som også andre statslige forskningsinstitutioner uden for Københavns Universitet, f.eks. DTU og OU, havde adgang til.
Computernes øgede regnekraft gjorde det efterhånden også muligt at foretage andre former for dataanalyser af de basale NMR-signaler end FT-analysen for at forøge dispersionen og signal/støj-forholdet. Et godt eksempel er de Linear Prediction (LP)-analyser, som Henrik Gesmar udviklede under sit ph.d.-studium ved Kemisk Laboratorium V. LP-teknikken er især velegnet til analyse af komplicerede NMR-spektre som f.eks. et 13C NMR-spektrum af insulin optaget med 13C i naturlig forekomst, figur 6. Den eneste forudsætning for at kunne foretage en LP-analyse er, at de tidsafhængige henfald, som FID-signalet indeholder, er Lorentzfunktioner, hvilket med god tilnærmelse gælder i praksis.
Resultatet af en LP-analyse er de fire parametre, der karakteriserer ethvert NMR-signal, dvs. signalets frekvens, , intensitet, I, liniebredde, R2 og fase, . Ud fra disse parametre kan man herefter beregne det endelige spektrum uden støj som vist i figur 6b. Udviklingen af LP-teknikken ved Kemisk Laboratorium V førte til mere end 15 publikationer i førende internationale tidsskrifter [5,6], og gav anledning til stor international opmærksomhed og anerkendelse.
De mange forbedringer af den spektrale dispersion og signal/støj-forholdet betød, at man ved hjælp af NMR-spektroskopi kunne studere større og større molekyler. Det var – og er – dog fortsat vanskeligt at få detaljeret information om biologiske makromolekylers struktur og funktion ud fra de en-dimensionale spektre (spektre med kun en frekvensakse) på grund af deres enorme kompleksitet – med mindre man kan identificere enkelte specifikke signaler, som har betydning for makromolekylernes biologiske funktion. Et eksempel på det sidstnævnte er signalerne fra CO2/HCO3¯-substratet i nærværelse af enzymet kulsyreanhydrase. Her blev det vist, at enzymets aktivitet kan bestemmes ved at måle relaxationshastigheden af 13C-kernerne fra 13CO2 og H13CO3¯¯-substraterne i nærværelse af enzymet og efterfølgende bestemme 13CO2 H13CO3¯¯-omdannelseshastigheden såvel som de to 13C relaxationshastigheder og afstanden mellem metalionen og 13C kernen i det intermediære metalion -H13CO3¯¯-kompleks ud fra signalintensiteternes tidsafhængigheder [7].
Med den store udvikling af NMR-spektroskopien, der således fandt sted i disse år, blev der afholdt et utal af større og mindre konferencer om emnet verden over. En af de mere markante fandt sted i Rom i 1984 og indbefattede et besøg hos Pave Johannes Paul II i Vatikanets Sala del Consistorio, figur 7.
* Jens Jørgen Led er ph.d. og Dr. Scient. Han blev ansat ved Kemisk Institut, Københavns Universitet i 1968, hvor han har været leder af Protein-NMR forskningsgruppen samme sted fra 1986 til 2008. Han er i dag docent emeritus samme sted.
Referencer
1. Bloch F., Hansen W.W., Packard M., Nuclear Induction. Phys. Rev. 1946, 69, 127-127.
2. Purcell E.M., Torrey H.C., Pound R.V. Resonance Absorption by Nuclear Magnetic Moments in Solids. Phys. Rev. 1946, 69, 37-38.
3. Proctor W.G., Yu F.C. The Dependence of a Nuclear Magnetic Resonance Frequency upon Chemical Compound. Phys. Rev. 1950, 77, 717-717.
4. Ernst R.R., Anderson W.A. Application of Fourier Transform Spectroscopy to Magnetic Resonance. Rev. Sci. Instrum. 1966, 37, 93-102.
5. Gesmar H., Led J.J., Abildgaard F. Improved Methods for Quantitative Spectral Analysis of NMR Data. Prog. NMR Spectrosc. 1990, 22, 209-288.
6. Led J.J., Gesmar H. Application of the Linear Prediction Method to NMR Spectroscopy. Chem. Rev. 1991, 91, 1413-1426.
7. Led J.J., Neesgaard E., Johansen J.T. Carbon-Dioxide Hydration Activity and Metal-Substrate Distances of Manganese (II) Human Carbonic Anhydrase-B Determined by C-13 Magnetization Transfer NMR. FEBS Lett. 1982, 47, 74-80.