Dette er anden artikel i en serie på tre om NMR-spektroskopiens udvikling. Artikel 3 bliver bragt i Dansk Kemi nr. 11.
Her om indførelsen af multidimensional NMR-spektroskopi.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 10, 2015 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af Jens Jørgen Led*,
Kemisk Institut, Københavns Universitet
Mens det første kvantespring inden for NMR-spektroskopien var indførelsen af Puls-Fourier Transformation (Puls-FT)-teknikken, var det andet kvantespring udviklingen af den multidimensionale (to-dimensionale) NMR-spektroskopi med to eller flere frekvensakser.
Den multidimensionale NMR-spektroskopi gjorde det med et slag muligt at forøge opløsningsevnen betydeligt samtidig med, at den gjorde det muligt at identificere (tilordne) de enkelte signaler i komplicerede NMR-spektre af biomakromolekyler, herunder proteiner, og bestemme deres tre-dimensionale struktur i vandig opløsning – hvis biomakromolekylerne har en veldefineret rumlig struktur.
Udviklingen og indførelsen af den multidimensionale NMR-spektroskopi skyldes først og fremmest de to forskere, Richard R. Ernst, som udviklede teknikken [1] og Kurt Wüthrich, som demonstrerede dens anvendelighed til bestemmelse af biomakromolekylers (proteiners) struktur i opløsning [2]. De to forskere, figur 1 og 2, fik Nobelprisen i kemi for deres forskning i henholdsvis 1991 og 2002.
Multidimensional NMR-spektroskopi
Multidimensional NMR-spektroskopi bygger på to basale eksperimenter: COSY (correlation spectroscopy)-eksperimentet og NOESY (nuclear overhauser enhancement spectrocopy)-eksperimentet. Alle de øvrige multidimensionale eksperimenter er i det væsentlige afledt af disse to. COSY-eksperimentet korrelerer spektrets signaler gennem de kemiske bindinger via spin-spin-koblingerne mellem de kerner, der giver anledning til signalerne. Som vist i figur 3B ses disse korrelationer som signaler uden for diagonalen (cross peaks), mens de oprindelige signaler, som ses i det en-dimensionale spektrum, figur 3A, ligger langs diagonalen i det to-dimensionale spektrum. Tilsvarende vil NOESY-eksperimentet korrelere signalerne gennem rummet via dipol-dipol-koblingerne mellem kernerne. Herefter kan man i princippet, ud fra cross peak’enes intensiteter og et passende regneprogram, bestemme de relative størrelser af afstandene mellem de kerner, der giver anledning til cross peak’ene og herigennem beregne strukturen af molekylet. Det simple COSY-spektrum i figur 3B viser, hvordan teknikken ikke blot forøger den spektrale opløsning dramatisk ved at placere signalerne i et to-dimensionalt plan og ikke kun i én dimension langs en linje, men også direkte afslører hvilke kerner (signaler), der kobler (korrelerer) indbyrdes. Ideen bag den to-dimensionale teknik kan udvides til flere dimensioner, især når der er flere forskellige koblende kerner involveret (1H, 13C, 15N), og der er tale om store molekyler med komplicerede spektre.
Insulin-forskningssamarbejde med Nordisk Gentofte og Novo Nordisk
Ved Kemisk Institut, Københavns Universitet, blev den nye multi-dimensionale NMR-teknik indført i 1988 ved køb af et Bruker 500 MHz NMR-spektrometer, figur 4 og et VAX regneanlæg, som Teknologistyrelsen bevilgede til et nyt Protein-NMR Videncenter, som blev drevet af Protein-NMR Gruppen ved Instituttet med mig som leder. Gruppens forskning samt dens drift af udstyret blev økonomisk støttet af Nordisk Gentofte (Novo Nordisk fra 1989) over en seks-årig periode mod til gengæld, at gruppen, sammen med forskere fra Nordisk Gentofte, skulle studere strukturen og funktionen af en række proteiner, som Nordisk Gentofte og senere Novo Nordisk var interesseret i. Endvidere blev gruppen støttet af det daværende Statens Naturvidenskabelige Forskningsråd og Statens Tekniskvidenskabelige Forskningsråd.
Den forbedrede multidimensionale NMR-teknik gjorde det muligt at bestemme opløsningsstrukturen af en lang række proteiner, som kun vanskeligt lader sig krystallisere. Det gælder f.eks. plastocyanin fra anabaena variabilis [3] og Human Relaxin-like Factor [4].
Samarbejdet med Nordisk Gentofte og Novo Nordisk blev særdeles frugtbart. Sammen med forskere fra de to virksomheder publicerede gruppen således i de følgende år mere end 15 videnskabelige artikler i internationale videnskabelige tidskrifter og mere end 20 artikler med relation til proteiner af interesse for disse virksomheder.
Et væsentligt problem for mange proteiner, som NMR-studierne ved Kemisk Institut kunne kaste lys over, er den selvassociering eller aggregering, der ofte forekommer i vandige opløsninger af proteiner ved de koncentrationer, der normalt forekommer ved produktion, formulering og dosering af proteinerne. Det gælder blandt andet væksthormoner, insulin, glucagon-like peptide-1 (GLP-1, Liraglutide eller Victoza) og human væksthormon (hGH).
Insulinhexameren er væsentlig for langtidsvirkende insulin. For i detaljer at klarlægge årsagerne til hexamerdannelsen bestemte Protein-NMR Gruppen strukturen af insulinhexameren i vandig opløsning [5,6], figur 5. Omvendt er monomerformen afgørende for hurtigvirkende insuliner og gruppen undersøgte derfor også, i samarbejde med forskere ved Nordisk Gentofte og Novo Nordisk, stukturen og funktionen af en række insulinmutanter [7-9] for at finde frem til en monomerinsulin, figur 6.
Andre forskningssamarbejder om insulin og relaterede proteiner
Samarbejdet med Novo Nordisk om insulin sluttede i midten af 1990’erne, hvor en insulinforskergruppe ved Novo Nordisk selv ønskede at overtage al insulinforskning. På grundlag af de erfaringer, der var opnået med insulinmutanterne, og gennem et samarbejde med Bartholin Instituttet på Rigshospitalet, lykkedes det dog Protein-NMR Gruppen ved Kemisk Institut at fremstille og undersøge en insulinmutant, der både var monomer og ca. 50% mere aktiv end den native monomere insulin [10,11]. Samtidig var mutanten uden en veldefineret struktur i vandig opløsning og antog kun den native insulins struktur i en helixfremmende vandig opløsning af 2,2,2-trifluoroethanol. På det grundlag blev det antaget, at den øgede aktivitet skyldtes den delvist udfoldede tilstand i vandig opløsning – en tilstand som den native insulin må igennem for at binde sig til sin receptor [6], figur 7. Denne antagelse er for nyligt blevet bekræftet af andre forskere [12].
Selvassocieringen af glucagon-like peptide-1 (GLP-1, Victoza) [13,14] og af human Væksthormon (hGH) er også vigtige problemer, som Protein-NMR Gruppen bidrog til opklaring af sammen med forskere fra Novo Nordisk og Nordisk Gentofte samt forskere fra Yale University, USA [15-17]. Især hGH viste sig at være vanskeligt at studere ved hjælp af NMR-spektroskopi. Det skyldtes proteinmolekylets størrelse og dets mange muligheder for svage selvassocieringer. Tilsammen førte dette til komplicerede spektre med relativ brede og overlappende signaler og proteinaggregeringer selv ved proteinkoncentationer, der set fra et NMR-synspunkt var lave.
En nærmere undersøgelse af aggregeringen af hGH måtte derfor afvente endnu et kvantespring inden for NMR-spektroskopien i form af de superfølsomme og superkølede prøvehoveder, de såkaldte cryoprober, som beskrives nærmere i den tredje artikel i Dansk Kemi om NMR-spektroskopiens historie.
Udvikling af NMR-metodikken
Sideløbende med de mange studier af proteinstrukturer fandt der en udvikling af selve NMR-metodikken sted. Her fokuserede Protein-NMR gruppen især på metoder, der kunne forbedre den kvantitative bestemmelse af de NMR-parametre, der er nødvendige for proteinstudierne. Det gælder således bestemmelsen af de meget hurtige relaxationstider for kerner, der sidder tæt ved paramagnetiske ioner [18], og som er af betydning ved paramagnetiske studier af proteiner, som vil blive nærmere omtalt i den tredje artikel i denne serie. Ligeledes blev der fokuseret på præcise bestemmelser af NMR-signalernes intensiteter i proteinspektrene [19], der er afgørende for strukturbestemmelsen af proteiner ud fra NOESY-spektrene, og på nøjagtige bestemmelser af udvekslingshastighederne af proteinernes amidprotoner [20,21], der også er vigtige for opklaring af proteiners stuktur og funktion i vandig opløsning.
* Jens Jørgen Led er ph.d. og Dr. Scient. Han blev ansat ved Kemisk Institut, Københavns Universitet i 1968, hvor han har været leder af Protein-NMR forskningsgruppen fra 1986 til 2008. Han er i dag docent emeritus samme sted.
Referencer
1. Aue WP, Bartholdi E, Ernst RR, Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J Chem Phys 1976;64: 2229-2246.
2. Zuiderweg ERP, Kaptein R, Wüthrich K, Secondary structure of the lac repressor DNA-binding domain by two-dimensional 1H nuclear magnetic resonance in solution. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 5837-5841.
3. Badsberg U, Jørgensen AMM, Gesmar H, Led JJ, Hammerstad JM, Jespersen LL, Ulstrup J. Solution Structure of Reduced Plastocyanin from the Blue-Green Alga Anabaena variabilis. Biochemistry 1996 35, 7021-7031.
4. Büllesbach EE, Hass MAS, Jensen MR, Hansen DF, Kristensen SM, Schwabe C, Led JJ. Solution Structure of a Conformationally Restricted Fully Active Derivative of the Human Relaxin-like Factor. Biochemistry 2008, 47, 13308-13317.
5. Chang X, Jørgensen AMM, Bardrum P, Led JJ. Solution structures of the R6 human insulin hexamer. Biochemistry 1997, 36, 9409-9422.
6. O’Donoghue SI, Chang X, Abseher R, Nilges M, Led JJ. Unraveling the symmetry ambiguity in a hexamer: Calculation of the R6 human insulin structure. J. Biomol. NMR 2000, 16, 93-108.
7. Kristensen SM, Jørgensen AMM, Led JJ, Balschmidt P, Hansen FB. Proton Nuclear Magnetic Resonance Study of the B9(Asp) Mutant of Human Insulin. Sequential Assignment and Secondary Structure. J. Mol. Biol. 1991, 218, 221-231.
8. Jørgensen AMM, Kristensen SM, Led JJ, Balschmidt P. Three-Dimensional Solution Structure of an Insulin Dimer. J. Mol. Biol. 1992, 227, 1146-1163.
9. Jørgensen AMM, Olsen HB, Balschmidt P, Led JJ. Solution structure of the superactive monomeric Des-[Phe(B25)] human insulin mutant: Elucidation of the structural basis for the monomerization of Des-[Phe(B25)] insulin and the dimerization of native insulin. J. Mol. Biol. 1996, 257, 684-699.
10. Keller D, Clausen R, Josefsen K, Led JJ. Flexibility and Bioactivity of Insulin: an NMR Investigation of the Solution Structure and Folding of an Unusually Flexible Human Insulin Mutant with Increased Biological Activity. Biochemistry 2001, 40, 10732-10740.
11. Clausen C, Jørgensen TG, Jørgensen KH, Johnsen AH, Led JJ, Josefsen K. The (ProB27, ThrB28) human insulin analogue is more potent and more rapidly absorbed from subcutis than human insulin. Eur. J. Endocrinology 2002 147, 227-233.
12. Menting JG, et. al. Protective hinge in insulin opens to enable its receptor engagement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2014, 111, E3395- E3404.
13. Chang X, Keller D, Bjøn S, Led JJ, Structure and folding of glucagon-like peptide-1-(7-36)- amide in aqueous trifluoroethanol studied by NMR spectroscopy. Magn. Reson. Chem. 2001, 539, 477-483.
14. Chang X, Keller D, O’Donoghue SI, Led JJ. NMR studies of the aggregation of glucagon-like peptide-1: formation of a symmetric helical dimer. FEBS Lett, 2002, 515, 165-170.
15. Abildgaard F, Jørgensen AMM, Led JJ, Christensen T, Jensen EB, Junker F, Dalbøge H. Characterization of Tertiary Interactions in a Folded Protein by NMR Methods: Studies of pH-Induced Structural Changes in Human Growth Hormone. Biochemistry 1992, 31, 8587-8596.
16. Kasimova MR, Kristensen SM, Howe PWA, Christensen T, Matthiesen F, Petersen J, Sørensen HH, Led JJ. NMR Studies of the Backbone Flexibility and Structure of Human Growth Hormone: A Comparison of High and Low pH Conformations. J. Mol. Biol. 2002, 318, 679-695.
17. Jensen MR, Kristensen SM, Keeler C, Christensen HEM, Hodsdon ME, Led JJ. Weak self-association of human Growth Hormone investigated by nitrogen-15 NMR relaxation. Proteins 2008, 73, 161-172.
18. Hansen DF, Led JJ, Measuring the Longitudinal NMR Relaxation Rates of Fast Relaxing Nuclei Using a Signal Eliminating Relaxation Filter. J Magn Reson 2001; 151: 339-346.
19. Gesmar H, Nielsen PF, Led JJ, Simple Least-Squares Estimation of Intensities of Overlapping Signals in 2D NMR spectra. J Magn Reson Ser B 1994;103: 10-18.
20. Olsen HB, Gesmar H, Led JJ, Slow Amide Proton Exchange Rates from the Line Widths in a Single Two-Dimensional 1H NMR Spectrum. J Am Chem Soc 1993; 115: 1456-1460.
21. Moss R, Gesmar H, Led JJ, A New Linear Prediction Model Method for the Determination of Slow Amide Proton Exchange Rates from a Series of One-Dimensional 1H NMR Spectra. J Am Chem Soc 1994;116: 747-749.