Metal-DNA-nanoteknologi baner vejen for nye produkter inden for biomedicin, biosensorer og diagnostik.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2023 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af Pratik Shah1, Peter W. Thulstrup2 og Morten J. Bjerrum2
1 Institut for Naturvidenskab og Miljø, Roskilde Universitetscenter
2 Kemisk Institut, Københavns Universitet
DNA-komplekser af ædelmetaller repræsenterer en type unikke forbindelser med en lang række fascinerende og interessante egenskaber. Metalholdige DNA-forbindelser kan anvendes inden for biologiske målemetoder (biosensorer, billeddannelse, diagnostik) samt til udvikling af innovativ medicin og målrettet lægemiddeloptagelse.
Et tværfagligt kig på DNA’s rolle og potentiale
Nukleinsyrer (DNA og RNA, se faktaboks) er fascinerende molekyler for både biologer, kemikere og fysikere. For biologer er DNA og RNA essentielle kernekomponenter og livets kode som bærere af genetisk information på tværs af generationer. For kemikere er DNA og RNA spændende makromolekyler, der via kemisk syntese kan udstyres med nye egenskaber. For fysikere er DNA en byggesten til at designe nye materialer, der kan samle sig selv til komplekse geometriske strukturer på nanoskala, hvilket tiltrækker yderligere interesse fra områder inden for materiale- og ingeniørvidenskab. DNA-nanoteknologi er således opstået på en tværfaglig platform, der integrerer viden, ideer og visioner fra flere discipliner for at udvikle nye DNA-baserede nanomaterialer (figur 1). DNA er blandt andet interessant på grund af den forudsigelige måde, hvorpå DNA opfører sig, hvilket er centralt for dets biologiske rolle og dets replikation. I de senere år er det imidlertid erkendt, at den naturlige DNA-kemi er langt mere varieret end først antaget, hvilket vi vender tilbage til senere i artiklen.
Alternativ DNA-kemi:
Metalioners unikke samspil med nukleinsyrer
Gennem årene har kemikere udforsket mange forskellige alternativer til den naturligt forekommende DNA-kemi. Den kemiske struktur af DNA er ideel til metalbinding via fosfatgrupperne i DNA-molekylets rygrad og via de heteroaromatiske nukleobaser. Når DNA tages ud af det biologiske miljø og ned i reagensglasset, udvides mulighederne for at udnytte samspillet mellem DNA og metalioner drastisk. Metalioner interagerer fundamentalt med nukleinsyrer på én af tre måder. For det første danner metalioner såsom magnesium, natrium og kalium elektrostatiske interaktioner med fosfatgrupperne. For det andet interagerer en række overgangsmetalioner, herunder også en række lanthanider, med både fosfat og baser. For det tredje interagerer blandt andet metalioner af Ag, Au og Cu med nitrogenholdige baser, hvor de i det væsentlige kan erstatte hydrogenbinding med metalmedieret baseparring.
I laboratoriet kan DNA via selvansamling antage bestemte 3-dimensionelle strukturer via valg af sekvenskomplementaritet og kemiske additiver. Interaktioner mellem DNA og metalioner åbner nye muligheder for at bruge DNA til at danne nanomaterialer med en kontrolleret morfologi og unikke egenskaber. DNA-strukturer kan også udnyttes til at fungere som skabelon til at organisere metalliske nanomaterialer, nemlig de såkaldte metal-nanoclusters. Metal-nanoclusters (dansk: nanoklynger) er mindre end 2 nm i størrelse og er en særlig gruppe af nanopartikler, idet disse nanoclusters for et givent metal består af en blanding af positive metalioner og neutrale metalatomer. Mange ædle grundstoffer såsom Cu, Au og Ag har vist sig at danne nanoclusters med attraktive optiske egenskaber. Sølv nanoclusters (AgNC) har fået særlig opmærksomhed på grund af deres stærke og justerbare fluorescens, fotostabiliteten og den store forskydning mellem exitations- og emissionsbølgelængden (figur 2). Man kan betragte et DNA-kompleks af et AgNC som et multi-atom fluorescerende nanomateriale.
DNA-indkapslede fluorescerende sølv nanoclusters
De attraktive egenskaber ved AgNC’er blev først undersøgt i gasfase [1], men blev bragt tættere på bioteknologiske og biomedicinske anvendelser af en vigtig opdagelse i 2004. Her viste Petty et.al., at DNA kan bruges som skabelon til syntese af fluorescerende AgNC’er i en vandig opløsning [2]. Brugen af biokompatibelt DNA som skabelon og syntese under fysiologisk relevante forhold åbnede nye muligheder for praktiske biomedicinske anvendelser af DNA-indkapslede fluorescerende sølv nanoclusters (DNA/AgNC’er). Sølvioner foretrækker at binde til N3 fra cytosiner samt N7 og O6 i guaninbaser. Cytosinrige DNA’er er nogle af de mest brugte skabeloner til binding af Ag0/Ag+. Der har således inden for de sidste 10 år været en eksplosion i antallet af DNA-sekvenser, der har vist sig at indkapsle fluorescerende AgNCs rettet mod anvendelse af DNA/AgNCs fluorescens i biosensorer, billeddannelse og i diagnostik.
I starten betragtedes DNA som en rigid skabelon, der fungerer som et passivt templat bindingssted for den fluorescerende Ag0/Ag+ nanoclusterstruktur. Nye undersøgelser har imidlertid godtgjort, at DNA også er en aktiv del af systemet, så DNA-sekvensen og strukturen kan bruges til at modulere fluorescensen af AgNC’er. Vi viste således allerede i 2012 [3], at den sekundære struktur af DNA kan spille en vigtig rolle i syntesen af fluorescerende AgNC’er. I 2018 viste vi endvidere [4], at den tertiære struktur af DNA også kan spille en vigtig rolle i at modulere de fluorescerende egenskaber af AgNC’er. I dette system gav den syntetiske AgNCs anledning til en dimerstruktur af DNA med orange fluorescens, mens AgNC’er i den monomere DNA-hårnålestruktur udsendte rød fluorescens.
DNA-dimerisering via interagerende hårnåle
Vores første antagelse var, at den orange AgNC dimerstruktur var en dimer dannet via Watson-Crick-baseparring af dobbeltstrenget DNA, hvor AgNC’er er bundet til cytosiner i den dobbeltstrengede DNA-struktur. Denne antagelse blev tilsyneladende understøttet af den første rapporterede krystalstruktur af grøn-emissive AgNC’er. Vores fortsatte studier af den dimere DNA-struktur viste dog utvetydigt til vores overraskelse, at den dimeriserede DNA-struktur involverede metal-medierede basepar-interaktioner mellem to DNA-molekyler. De orange fluorescerende AgNC’er forbinder DNA via non-konventionel baseparring, der involverer Cytosin-Ag-Ag-Cytosin-binding. Flere komplementære tilgange viste endegyldigt, at den baseparring, der identificeres her, er unik og involverer basepar-metal og metal-metal-interaktioner, ligesom dette fremgår af den første krystalstruktur af et nærinfrarødt fluorescerende DNA-AgNC kompleks [5].
Vi betragter vores observation af sammenkædning af to DNA-hårnåle som en meget vigtig fundametal egenskab ved AgNC’er (figur 3). Denne vekselvirkning repræsenterer en ny type bindingsinteraktion mellem naturligt genetisk materiale, der er fuldstændig styret af det syntetiske nanomateriale, og som ikke kan findes i naturen. Forståelsen af de kræfter, der driver vekselvirkningen, kræver nærmere undersøgelser, så man på sigt kan forudsige og modulere fluorescensen af DNA-AgNC systemer.
Hoogsteen baseparring som alternativ templat
Efter at have påvist betydningen af den sekundære struktur for DNA i forhold til de fluorescerende egenskaber af AgNC’erne, undersøgte vi, om DNA kan forsyne de indkapslede AgNC’er med nye egenskaber ved at erstatte hårnåle-DNA-strukturen med den mindre kendte triplex-DNA-struktur (figur 4).
I de seneste år har Hoogsteen baseparret triplex-DNA-struktur fået meget opmærksomhed på grund af dets potentiale i oligo-baserede terapeutika, der kan hæmme molekylære processer som transkription, translation og protein-DNA-interaktion. Et andet vigtigt aspekt af triplex-DNA er evnen til reversibelt at ændre dets struktur som reaktion på pH. Hoogsteen basepar destabiliseres ved basisk pH, mens det kan gendanne strukturen ved sur pH. Ved at erstatte hårnåle-DNA-struktur med Hoogsteen-baseparret triplex-DNA-struktur fandt vi ud af, at fluorescerende AgNC’er blev dynamisk pH-responsive [6]. Dette var et interessant casestudie, som viste, at et DNA-biomolekyle kan regulere egenskaberne af et nanomateriale. DNA-molekylet vil ”fornemme” ændringerne i pH og vil reversibelt ændre konformation som reaktion på pH, hvilket vil ændre den fluorescerende egenskab af AgNC’er. Dette gjorde det muligt for os at udvikle en pH-følsom DNA-AgNC, der potentielt kan vise pH-variationer i cellulære eller subcellulære miljøer, og dermed give indsigt i pH-afhængige processer og interaktioner via ændret AgNC emission.
Desuden forventer vi, at vores resultater inspirerer til udvikling af pH-responsive DNA-systemer, der selektivt kan frigive associerede molekyler, såsom lægemidler eller kontraststoffer, via reaktion på specifikke pH-betingelser med henblik på målrettet levering og forbedret terapeutisk effektivitet. Som et kuriosum mener vi, det er bemærkelsesværdigt, at vi har udviklet et DNA-baseret nanomateriale, der involverer tre forskellige typer af baseparringssystemer i en enkelt samling: Watson-Crick hydrogenbaseparring, Hoogsteen baseparring og syntetisk metal nanocluster-medieret baseparring [6].
Nye muligheder med RNA
Inden for det sidste årti har man identificeret en række RNA-molekyler i cellerne, som er med til at styre cellernes funktion på måder, man ikke var klar over tidligere. Disse RNA-typer kan ofte fungere som indikatorer for specielle tilstande, blandt andet i forbindelse med sygdom. Variationer i niveauerne af bestemte såkaldte mikroRNA-biomarkører (miRNA) er blevet identificeret i flere sygdomme som cancer, diabetes, neurodegenerative og hjerte-kar-sygdomme. Imidlertid er fraværet af egnede metoder til påvisning af miRNA’er et af de begrænsende trin, der forhindrer brugen af miRNA’er som biomarkører til diagnose i klinisk sammenhæng. Ved at bruge den fluorescerende egenskab af DNA/AgNC’er har vi undersøgt mulighederne for at udvikle nye biosensorer rettet mod miRNA’er til tidlig sygdomsdiagnostik ved for eksempel cancer (figur 5). Vi har således demonstreret en hurtig, enkel, billig og effektiv brug af DNA/AgNC’er til effektiv måling af mikroRNA-biomarkører [7]. Vi forudser, at der kommer reelle medicinske og diagnostiske gennembrud på forskellige områder via denne teknologi.
Anvendelserne af metal-DNA-nanoteknologi er enorme, og kan også komme til at omfatte områder såsom avanceret nanoelektronik og miljøovervågning, og vi ser frem til en spændende fremtid for disse ekstraordinære hybridstrukturer.
E-mail:
Morten J. Bjerrum: mobj@chem.ku.dk
Peter W. Thulstrup: pwt@chem.ku.dk
Pratik Shah: shah@ruc.dk
Referencer
1. Felix, C., et al., Ag8 fluorescence in argon. Phys Rev Lett 86, 2001, 2992-5.
2. Petty, J.T., et al., DNA-templated Ag nanocluster formation. Journal of the American Chemical Society 126, 2004, 5207-12.
3. Shah, P., et al., Design aspects of bright red emissive silver nanoclusters/DNA probes for microRNA detection. ACS Nano 6, 2012, 8803-14.
4. Shah, P., et al., The structural shift of a DNA template between a hairpin and a dimer tunes the emission color of DNA-templated AgNCs. Nanoscale 10, 2018, 20717-22.
5. Cerretani, C., et al., Crystal structure of a NIR-Emitting DNA-Stabilized Ag(16) Nanocluster. Angew Chem Int Ed Engl 58, 2019, 17153-57.
6. Nagda, R., et al., Silver Nanoclusters Serve as Fluorescent Rivets Linking Hoogsteen Triplex DNA and DNA Structures. ACS Nano 16, 2022, 13211-22.
7. Shah, P., et al., Locking-to-unlocking system is an efficient strategy to design DNA/silver nanoclusters (AgNCs) probe for human miRNAs. Nucleic Acids Res 44, 2016, e57.
FAKTABOKS:
DNA er bygget op af nukleotider. Hvert nukleotid består af en nitrogenholdig nukleobase, enten cytosin (C), guanin (G), adenin (A) eller thymin (T), såvel som en sukker kaldet deoxyribose og en fosfatgruppe. Nukleotiderne forbindes med hinanden i en kæde af kovalente bindinger mellem deoxyribose fra det ene nukleotid og fosfat fra det andet, hvilket resulterer i en alternerende deoxyribose-fosfat-rygrad. Mest kendt er den klassiske struktur afdækket af Francis Crick, Rosalind Franklin, James Watson og Maurice Wilkins. Dette er en såkaldt B-form, dobbeltspiralformet struktur sammensat af to antiparallelle DNA-strenge, der holdes sammen af Watson-Crick-basepar, hvorved fire nitrogenholdige baser interagerer via hydrogenbindinger på en specifik måde, nemlig Adenin-parring med Thymin og Guanin-parring med, Cytosin. Ribonukleinsyre (RNA) består ligesom DNA af kæder af nukleotider, men i RNA indgår ribose i de kovalente bindinger og nukleobasen thymin er erstattet med uracil (U).
