Resultaterne fra nærværende EU-forskningsprojekt indikerer, at de anbefalede nedbrydningssimuleringstest bør modificeres, så de bedre afspejler de forhold, der er gældende, når veterinære lægemidler nedbrydes i jordmiljøet. Dette kan gøres ved at testene udføres i jord – møg/gylle blandinger.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2008 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Kristine Andersen Krogh, Gitte Gotholdt, Jensen Susanne Hermansen og Bent Halling-Sørensen
Det Farmaceutiske Fakultet, Institut for Farmaci og Analytisk Kemi, Københavns Universitet
Forskningen, der beskrives er udført i forbindelse med EU-forskningsprojektet ERAPharm, (Environmental Risk Assessment of Pharmaceuticals), hvis hovedformål har været at udføre en risikovurdering af et humant (atenolol) og et veterinært (ivermectin) anvendt lægemiddel for at vise om de risikovurderingsprocedurer, der er foreslået også er velegnet for lægemidler. Den gældende risikovurdering for humane og veterinære lægemidler er beskrevet af EMEA (European Medicines Agency) [1]. Risikovurderingen angiver blandt andet hvilke tests, der skal gennemføres for at forudsige stoffernes skæbne i både jord- og vandmiljøet. Vores arbejde har koncentreret sig om ivermectin (figur 1) et lægemiddelstof der primært ender i jordmiljøet hvorfor artiklen kun omhandler dette.
Ivermectin – et veterinært lægemiddel
Ivermectin er et af de mest anvendte antiparasitære midler i Danmark, Europa samt Nordamerika. Forskellige doseringsformer såsom oralt, pour-on (pulver der strøgs på ryggen af dyrene) og injektion anvendes til behandling af kvæg, får og heste. Uafhængigt af doseringsformen ender ivermectin i jordmiljøet enten direkte ved run-off eller wind drift fra dyr (dette gælder kun for pour-on produkterne) eller indirekte via fæces. Ivermectin udskilles næsten udelukkende via fæces [2] heraf 39-61 % umetaboliseret [3]. I figur 2 ses eksponeringsvejene for hvordan ivermectin ender i miljøet.
Litteraturdata angiver, at ivermectin nedbrydes meget langsomt i jord med halveringstider, der ligger på T½= 173-240 dage og 93-132 dage i henholdsvis jord fra græsningsarealer og skovjord [3]. Forskere har de seneste mange år rapporteret om toksiske effekter af ivermectin på insekter og jordorganismer, der lever i møg, fæces samt jord [4-9]. Den toksiske effekt leder til langsommere nedbrydning af fæces fra behandlede dyr med den konsekvens, at dyrenes ekskrementer ikke umiddelbart forsvinder fra marken. Jensen et al. har estimeret, at man efter udbringning af møg/gylle indeholdende ivermectin fra behandlede dyr kan forvente en worst-case koncentration i jord (predicted environmental concentration, PEC) af ivermectin på omtrent 1.5 mg/kg tør vægt jord [9]. Til sammenligning er effektkoncentrationen for springhaler EC50 (reproduktion) = 1.7 mg/kg tørvægt [9]. Endvidere er ivermectin yderst giftigt overfor vandlevende organismer, hvis ivermectin ender i vandmiljøet. Den akutte letale effekt koncentration LC50 (48 h) for ivermectin overfor Daphnia magna er på bare 5 ng/l [10].
EMEAs risikovurdering for veterinære lægemidler
For at kunne udføre en risikovurderingen for ivermectin og herunder en refinement af PEC fandtes det nødvendigt i EU-projektet at udføre følgende test OECD Guideline for Testing of Chemicals: No. 106. Adsorption – Desorption Using a Batch Equilibrium Method [11] og OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 307. Aerobic and anaerobic transformation in soil [12]. Disse tests er alle udviklet til at kunne forudsige pesticiders skæbne i jordmiljøet. I modsætning til pesticider, som spredes i jordmiljøet i form af en vandig opløsning eller suspension, spredes veterinære lægemidler via græssende dyr eller spredning af gylle/møg på marker. Dette kan vise sig at være problematisk, hvorfor vi forslog nogle modifikationer til testene som bør tage højde for forskellen i spredningsmønsteret.
Sorption og desorption i jord
I henhold til OECD 106, blev der udført sorptionsforsøg med jord med forskellige fysikkemiske egenskaber [11]. De anvendte jorder var to landbrugsjorder fra Madrid (Spanien) og York (England) og en kunstig jord fra Tyskland [13]. Sorptionsforsøgene blev udført, ved at tilsætte en kendt koncentration af ivemectin til en blanding af jord og vandige CaCl2 opløsning (1/5). Efter 48 timers omrystning var sorptionsligevægten mellem jord- og vandfasen opnået. Ivermectin koncentrationen blev kvantificeret ved kemisk analyse (se figur 3 [14]) af ivermectin i både jorden og den vandige opløsning.
Fordelingskoefficienten (Kd) mellem jord og vand blev bestemt til at være mellem 57-397 l/kg afhængig af jorden. Hvis fordelingskoefficienten normaliseres i forhold til indholdet af organisk kulstof i jorden fås Koc = 4,00·103-2,58·104 l/kg. Ivermectin vil altså sorbere betydeligt til jord, men for nogle jorder kan det forventes, at ivermectin vil kunne findes i jordvandet og derfra kan ende i overfladevandet. Desuden undersøgte vi desorption fra de tre jorder. Desorptionen var meget lav, 2-9 % for den kunstige samt York jorden, mens den var 13-26 % for Madrid jorden [13]. Ivermectin vil altså sorbere til jorden og kun frigives i mindre grad.
Eftersom veterinære lægemidler og heriblandt ivermectin i vid udstrækning spredes på markerne via fæces, gylle eller møg, vil sorption/desorptionsforsøg i disse matricer give et mere realistisk billede af de faktiske forhold. Vi forslår derfor, at der laves sorption/desorption i blandinger af jord og møg/gylle, samt jord alene.
Nedbrydning i jord
Nedbrydningen i jord blev, som beskrevet i OECD 307 [12], undersøgt under aerobe (med ilt) og anaerobe (uden ilt) forhold. Udover de tre jorder anvendt til sorptionsforsøgene blev en dansk jord fra CRUCIAL markerne i Tåstrup benyttet [15]. Jorderne blev lufttørret og siet gennem en 2 mm si for at opnå en homogen blanding. Dernæst blev jorden vædet med vand for at opnå den påkrævede fugtighed som beskrevet i test guidelinen. Ivermectin blev tilsat til jorden, og prøverne blev omrystet og efterfølgende gennemboblet med henholdsvis luft (aerobe) og nitrogen (anaerobe). De anaerobe prøver blev forseglet i glasbeholdere for at bibeholde de anaerobe betingelser. Mens de aerobe betingelser blev opretholdt ved at opbevare prøverne i åbne glasbeholdere, som blev gennemboblet med luft hver 2-3 dag. Prøverne blev opbevaret i mørke for at undgå nedbrydning ved fotolyse. Nedbrydningen blev undersøgt ved to temperaturer 20ºC for alle fire jorde og 6ºC for Tåstrup og York jorderne. Der blev udtaget tre prøver på hvert af følgende tidspunkter dag 0, 1, 7, 14, 28, 42, 70 og 120. Prøverne blev frysetørret og derefter ekstraheret og analyseret (se figur 3).
De opnåede data blev modelleret til simple første ordens kinetik som angivet i OECD 307 [12]. Nedbrydningen i de aerobe prøver var meget afhængig af den testede jord, idet de hurtigste halveringstider kunne ses for landbrugsjorderne (T½ = 16.1-67.0 dage) i modsætning til den kunstige jord (T½ = 458 dage). Dette indikerer, at bakterier er ansvarlige for nedbrydningen i jorden. Når opbevaringstemperaturen faldt fra 20ºC til 6ºC, faldt nedbrydningshastigheden resulterende i længere halveringstider (T½ = 89-105 dage). Nedbrydning var næsten ubetydelig i de anaerobe prøver, idet 80 % af den initiale koncentration blev fundet efter 120 dage, og dette niveau var allerede nået efter 14 dage. Ivermectin nedbrydes langsomt i jord, især i jorde med ringe biologisk aktivitet.
Nedbrydning i blandinger af jord og fæces
Udover de ovenstående forsøg med nedbrydning i jord blev der også udført forsøg med nedbrydning i jord blandet med fæces. Den anvendte fæces var fra en kvie (estimeret vægt 450 kg), der 3 dage inden var blevet behandlet ved injektion med ivermectin 9 ml Ivomec® (10 mg/ml ivermectin opløsning, Merial Norden A/S, Skovlunde, Denmark). Fæces blev tilsat jorden i forholdet 3.5 og 7 % (m/m %, våd vægt) svarende til forventede mark koncentration, når der spredes 120 kg N/ha gylle og en kvie udgør 1.7 dyreenheder/ha. Prøver blev udtaget på følgende tidspunkter dag 0, 7, 14, 42 and 70 (n = 3).
Det ses af resultaterne, at nedbrydning forløber hurtigere i de aerobe prøver, når fæces blandes i jorden. Halveringstiden er henholdsvis T½ = 12 og 5 dage ved henholdsvis 3.5 og 7 % blandingerne, mens den er 37 dage i ren jord. I lignende forsøg med sulfadimethoxin (veterinært antibiotika) har man ligeledes observeret at nedbrydningshastigheden øges ved tilsætning af gylle [16]
Resultaterne samt data fra litteraturen indikerer at nedbrydning i jord og hvor jord blandes med møg/gylle/fæces ikke har samme nedbrydningshastighed. For bedre at kunne forudsige veterinære lægemidlers skæbne, er det derfor vigtigt at inddrage forsøg, hvor også jorden blandes i et naturligt forhold med møg/gylle/fæces. Eftersom matricerne møg/gylle/fæces er en meget heterogen størrelse kan det være svært at lave en standardiseret matrix. I forbindelse med CREAM, et forskningsprojekt finansieret af VELUX fonden, arbejdes der videre med dette forskningsområde.
ERAPharm
ERAPharm er et EU finansieret forskningsprojekt (EU nr. 511135) der var bevilliget inden for EU kommissionens 6. rammeprogram. ERAPharm projektet bestod af 15 partner fordelt over hele Europa, heraf to partnere var fra Danmark (FARMA og DMU) samt en partner fra Canada. Projektet blev afsluttet efter 3 år i oktober 2007.
Fig. 1Kemisk struktur af ivermectin.
Fig. 2 Veterinære lægemidlers skæbne i miljøet.
Fig. 3 Skematisk oversigt over prøveoprensning af jord- og vandige prøver med efterfølgende analyse ved brug af LC-MS/MS (se endvidere [14]).
Referencer
[1] EMEA. Guideline on the environmental impact assessment for veterinary medicinal products CVMP/ERA/418282/2005. Europeran Medicine Agency, London, UK. http://www.emea.europa.eu/pdfs/vet/era/41828205fin.pdf
[2] W.C.Campbell, M.H.Fischer, E.O.Stapley, G.Albers-Schönberg, T.A.Jacob. 1983 Science 221:823
[3] B.A.Halley, T.A.Jacob, A.Y.H.Lu. 1989 Chemosphere 18(7-8):1543
[4] R.Wall, L.Strong. 1987 Nature 327:418
[5] M.Madsen, J.Grønvold, P.Nansen, P.Holter. 1988 Acta Vetenaria Scandinavia 29:515
[6] C.Sommer, B.Steffansen, B.O.Nielsen, J.Grønvold, K.-M.V.Jensen, J.B.Jespersen, J.Springborg, P.Nansen. 1992 Bull. Ent. Res. 82:257
[7] K.G.Wardhaugh, P.Holter, W.A.Whitby, K.Shelley. 1996 Australian Veterinary Journal 74(5):370
[8] K.G.Wardhaugh, P.Holter, B.Longstaff. 2001 Australian Veterinary Journal 79(2):125
[9] J.Jensen, P.H.Krogh, L.E.Sverdrup. 2003 Chemosphere 50(3):437
[10] J.Garric, B.Vollat, K.Duis, A.Pery, T.Junker, M.Ramil, G.Fink, T.A.Ternes. 2007 Chemosphere 69(6):903
[11] OECD. 2000. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 106. Adsorption – Desorption Using a Batch Equilibrium Method, Paris, OECD
[12] OECD. 2002. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 307. Aerobic and anaerobic transformation in soil. Paris, OECD
[13] K.A.Krogh, T.Søeborg, B.Brodin, B.Halling-Sørensen. Submitted to J. Environ. Qual.
[14] K.A.Krogh, E.Bjorklund, D.Loffler, T.Ternes, B.Halling-Sørensen. (in prep)
[15] CRUCIAL (http://www.gf.life.ku.dk/Forsoegsgaarde/omfsg/arealer/ vaerksted/crucial.aspx)
[16] Q.Q.Wang, S.A.Bradford, W.Zheng, S.R.Yates. 2006 J. Environ. Qual. 35(6):2162
