• Facebook
  • LinkedIn
  • KONTAKT
  • ANNONCERING
  • OM KEMIFOKUS
  • PARTNERLOGIN

KemiFOKUS

Fokus på kemi

  • Analytisk kemi
  • Arbejdsmiljø/Indeklima
  • Biokemi
  • Biologi
  • Bioteknologi
  • Branchenyt
  • Energi
  • Fødevarekemi
  • Historisk kemi
  • Kemiteknik
  • Kemometri
  • Klikkemi
  • Klima og miljø
  • Lovgivning og patenter
  • Medicinalkemi
  • Nanoteknologi
  • Organisk kemi
  • Artikler fra Dansk Kemi

Artikler fra Dansk KemiKemiteknik03. 10. 2023 | Heidi Thode

Enzymatisk syntese af p-kumarinsyre

Artikler fra Dansk KemiKemiteknik03. 10. 2023 By Heidi Thode

In situ produktfjernelse med et vandigt to-fasesystem afhjælper enzyminhibering.

Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2023 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.

Læs originalartiklen her

Af Alexander Virklund1, Alex Toftgaard Nielsen2 og John M. Woodley1
1 Institut for Kemiteknik, Danmarks Tekniske Universitet
2 The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Danmarks Tekniske Universitet

Gennem de seneste årtier har der været fokus på at erstatte kemisk syntese eller biomasse-ekstrahering med fermentering eller enzymatisk syntese i håb om at opnå en mere effektiv og bæredygtig produktion. Dette er især relevant, hvor udbyttet er lavt grundet en kemisk syntese med mange trin eller et lavt indhold eller urenheder i biomassen. En god kandidat til enzymatisk syntese er p-kumarinsyre, det primære giftstof i kanel, men også en interessant forløber (precursor) blandt andet til produktionen af organiske halvledere til brug i elektronik [1]. Da p-kumarinsyre har antimikrobielle egenskaber, har enzymatisk syntese frem for fermentering vist sig at være det bedste bud i forbindelse med produktion af p-kumarinsyre [2]. Dog har produktinhibering af det relevante enzym vist sig at hæmme reaktionen [3]. Her beskrives vores udvikling af et vandigt to-fasesystem, som kan afhjælpe dette problem.

Produktinhibering af enzymet tyrosin ammoniak lyase
P-kumarinsyre kan dannes fra aminosyren tyrosin ved fraspaltning af ammoniak (figur 1), katalyseret af enzymet tyrosin ammoniak lyase (TAL). TAL-enzymer har begrænsede katalytiske kapaciteter (kcat), og dette forværres ved høje produktkoncentrationer, da p-kumarinsyre kan binde til det aktive center og konkurrerer med substratet tyrosin i at få adgang. Dette kan beskrives med en udvidelse af Michaelis Menten ligningen for enzymkinetik til at inkludere en inhibitor [4], i dette tilfælde p-kumarinsyre,

reaktion (1)

hvor v er reaktionshastigheden, [E] er enzymkoncentrationen, [S] er substratkoncentrationen, [I] er inhibitorkoncentrationen, KM er affiniteten til substratet, og Ki er affiniteten til inhibitoren. Selvom vi har identificeret en variant af TAL med relativt høj affinitet til tyrosin i forhold til p-kumarinsyre, er produktinhibering stadig et problem på grund af den lave opløselighed af tyrosin. Det er muligt at øge opløseligheden af tyrosin ved at øge temperaturen og pH [5,6], samt ved brug af kosolventer [7]. Der er dog en øvre grænse for, hvad enzymet kan tåle, og det har vist sig ikke at være muligt i tilstrækkelig grad at forhindre produktinhibering alene via temperatur, pH og brug af kosolventer (figur 2).

Vandigt to-fasesystem til ekstrahering af p-kumarinsyre
Vi ønskede en metode til at fjerne p-kumarinsyre in situ, samtidig med at det blev dannet. En typisk metode til in situ produktfjernelse er et to-fasesystem med en organisk fase oven på en vandig fase til ekstrahering af produktet. Dette virker dog ikke for p-kumarinsyre i denne enzymproces, da reaktionen foregår i en basisk opløsning, hvor TAL har højere aktivitet og tyrosin har højere opløselighed. I basisk opløsning er p-kumarinsyre ladet og foretrækker den vandige fremfor den organiske fase. Derfor undersøgte vi brugen af et vandigt to-fasesystem til ekstraktionen, som dannes, når to ikke-blandbare polymerer eller en polymer og en salt blandes i en vandig opløsning.
Vi afprøvede forskellige salte og polymerer, og fandt, at en opløsning af kaliumfosfat og poly(etylenglykol) dannede et stabilt vandigt to-fasesystem samt ekstraherede p-kumarinsyre til den øvre polymerfase med en fordelingskoefficient på op mod 13 afhængig af koncentrationerne. P-kumarinsyre absorberer lys i det synlige spektrum, hvilket giver det en gylden farve i tilstrækkelige koncentrationer, som let kan observeres med det blotte øje (figur 3).

In situ produktfjernelse af p-kumarinsyre
Selvom vi har identificeret et effektivt vandigt to-fasesystem til ekstrahering af p-kumarinsyre, var en proces til in situ produktfjernelse endnu ikke på plads, og yderligere udfordringer måtte løses. Det første var at teste TAL-enzymet i saltfasen, da den høje ionstyrke potentielt kunne have en negativ virkning på enzymet. Vi opdagede da også et fald i TAL-aktivitet, selv i en 10 procent vægt fosfatopløsning (figur 4), så vi fortyndede systemet og identificerede den laveste fosfatkoncentration nødvendig til at bevare to-fasesystemet. Det næste var at bevare enzymet i saltfasen og ude af polymerfasen. I stedet for et oprenset enzym benyttede vi en E. coli-stamme, som udtrykker TAL, men cellerne flød op til polymerfasen på grund af den høje densitet af saltfasen.
Vi immobiliserede derfor TAL-cellerne i kugler af en hydrogel (figur 5), så vi kunne pakke dem i en roterende kolonnereaktor (rotating bed reactor) placeret i saltfasen. Typisk pakker man immobiliserede enzymer i en kolonne-reaktor (packed-bed reactor) og pumper substratet igennem kolonnen kontinuerligt, men dette ville ikke fungere i nærværende enzymproces på grund af den lave opløselighed af tyrosin, som ville give en meget fortyndet produktstrøm. I stedet benyttede vi en batch-reaktion, hvor tyrosin er til stede i en opslæmning, kolonnen roterer for at øge overførslen af substrat igennem enzymet, og tyrosin går gradvist i opløsning, i takt med at den bliver omdannet til den mere opløselige p-kumarinsyre. Når reaktionen er til ende, kan de to faser tappes hver for sig, og p-kumarinsyren kan udfældes fra polymerfasen ved at sænke pH. De immobiliserede TAL-celler er klar til at blive genbrugt i næste batch, og salt og polymerfasen kan muligvis også genbruges.

Fortsat udvikling af processen
Mens et forsøg med de immobiliserede TAL-celler beskrevet her, nu er gennemført (figur 6), har vi endnu ikke sammenlignet systemet med en kontrol, hvorfor der endnu ikke foreligger resultater på, hvor effektiv metoden er til at øge p-kumarinsyre-produktionen. Vi håber dog at kunne vise en forbedring i p-kumarinsyre-produktionen, og at metoden kan bidrage til kommercialiseringen af p-kumarinsyre produktion via enzymatisk syntese, selvom yderligere optimering kan være nødvendig. Samtidig er dette projekt et af få eksempler på implementeringen af et vandigt to-fasesystem til in situ produktfjernelse, hvilket kan inspirere fremtidige processer.
Denne forskning er finansieret af Novo Nordisk Fonden gennem The Fermentation Based Biomanufacturing Initiative, fondsnummer: NNF17SA0031362.

E-mail:
Alexander Virklund: alvir@dtu.dk

Referencer
1. Ben-Bassat, A., Breinig, S., Crum, G.A., Huang, L., La Bonte Altenbaugh, A., Rizzo, N., Trotman, R.J., Vannelli, T., Sariaslani, F.S., & Haynie, S.L. (2007). Preparation of 4-vinylphenol using pHCA decarboxylase in a two-solvent medium. Organic Process Research and Development, 11(2), 278-285. https://doi.org/10.1021/op0602472.
2. Sariaslani, F.S. (2007). Development of a combined biological and chemical process for production of industrial aromatics from renewable resources. Annual Review of Microbiology, 61(1), 51-69. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.61.080706.093248
3. Virklund, A., Jendresen, C.B., Nielsen, A.T., & Woodley, J.M. (2023). Characterization of tyrosine ammonia lyases from Flavobacterium johnsonian and Herpetosiphon aurantiacus. Biotechnology Journal, 2300111. https://doi.org/10.1002/BIOT.202300111.
4. Segel, I.H. (1975). Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. John Wiley & Sons.
5. Lee, C.Y., Chen, J.T., Chang, W.T., & Shiah, I.M. (2013). Effect of pH on the solubilities of divalent and trivalent amino acids in water at 298.15 K. Fluid Phase Equilibria, 343, 30-35. https://doi.org/10.1016/J.FLUID.2013.01.010.
6. Samuel H. Yalkowsky, Yan He, P.J. (2006). Handbook of Aqueous Solubility Data, Second Edition (Vol. 1999, Issue December).
7. Li, X., Li, K., Farajtabar, A., He, Y., Chen, G., & Zhao, H. (2019). Solubility of d -Tryptophan and l -Tyrosine in Several Organic Solvents: Determination and Solvent Effect. Journal of Chemical and Engineering Data, 64(7), 3164-3169. https://doi.org/10.1021/acs.jced.9b00258.

Skrevet i: Artikler fra Dansk Kemi, Kemiteknik

Seneste nyt fra redaktionen

Vil du stå i spidsen for et af Danmarks ældste fagblade – Dansk Kemi søger ny redaktør

Top17. 09. 2025

Da vores redaktør, Hanne Christine Bertram, stopper, søger vi en redaktør til et af Danmarks ældste fagtidsskrifter, Dansk Kemi. Dansk Kemi bringer aktuel og dybdegående information om kemien og dens udvikling inden for industri, forskning og uddannelse. Bladet er desuden medlemsblad for Kemisk

Jubilæumsudgaven af Labdays i Aarhus er kommet godt fra start

BranchenytTop10. 09. 2025

Lige fra morgenstunden stod de første besøgende klar til at komme ind på LabDays messen, der i år afholdes i smilets by, Aarhus. Her kunne de finde oplagte udstillere, der gennem messens to dage står klar til at præsentere deres produkter, der inkluderer alt indenfor laboratorieverdenen. Der ud

Kvantealgoritmer og kemisk forståelse i åbne systemer

AktueltArtikler fra Dansk Kemi03. 09. 2025

Fra myten om den heroiske beregning til realistiske simuleringer af elektronoverførsel i åbne systemer med hukommelse. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 4, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) Af Lea K. Northcote1,2 og

Grøn kemi, affald og plast

AktueltArtikler fra Dansk KemiGrøn omstilling26. 08. 2025

Grøn kemi – læren om hvordan kemi udføres bæredygtigt og sikkert – bliver kun vigtigere. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 4, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) Af Christine Brænder Almstrup og Mikael Bols, Kemisk

Det gyldne mikrobiom: Tarmbakterier som kilde til det essentielle B-vitamin riboflavin

AktueltArtikler fra Dansk KemiBiokemiBioteknologiMedicinalkemi20. 08. 2025

Riboflavin er et essentielt vitamin, der spiller en nøglerolle for vores sundhed samt for at opretholde et sundt tarmmikrobiom. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) Af Emmelie Joe

Antibiotikaresistens i vores naturlige miljøer

AktueltArtikler fra Dansk KemiBiologi12. 08. 2025

Spredning af antibiotikaresistens kan ske via mineraloverflader. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) Af Karina Krarup Svenninggaard Sand, associate professor, Globe Institute,

Nye metoder giver indsigt i plantebaseret strukturdannelse

AktueltArtikler fra Dansk KemiFødevarekemi04. 08. 2025

Et afsluttet ph.d.-projekt fra Institut for Fødevarer ved Aarhus Universitet. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) Af Julie Frost Dahl*, Sandra Beyer Gregersen og Milena Corredig,

Hofmeister – nem at anvende, svær at forstå

AktueltArtikler fra Dansk KemiFødevarekemi23. 06. 2025

Franz Hofmeister opløste æggehvide i vandige saltopløsninger. En artikel fra 1888 beskriver, hvordan nogle ioner får proteiner til at udfælde, mens andre ioner har den modsatte effekt. Fødevarekemien bruger stadig Hofmeister, men langt mere nuanceret. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3,

Udvinding af fødevareproteiner fra kløvergræs ved membranteknologi

AktueltArtikler fra Dansk KemiFødevarekemi17. 06. 2025

Hvis kløvergræs skal kunne anvendes som ny ressource til udvinding af fødevareproteiner, kan membranteknologi være vejen frem. Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) Af Mette Lübeck, Mads

Trinatriumhexafluo… hvad for noget?

AktueltArtikler fra Dansk KemiHistorisk kemi09. 06. 2025

Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 2, 2025 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder(læs originalartiklen her) I år fejrer man internt i IUPAC 20-året for offentliggørelsen af The Red Book (i det følgende blot "RB2005") med anbefalinger vedrørende

Tilmeld Nyhedsbrev

Tilmeld dig til dit online branchemagasin/avis





Få fuld adgang til indlægning af egne pressemeddelelser...
Læs mere her

/Nyheder

  • Busch Vakuumteknik A/S

    OTTO Digital Services til systemer

  • DENIOS ApS

    Sådan får du op til 50 % mere lagerkapacitet

  • Holm & Halby

    VidensDage 2025: To dage med viden, visioner og værdi

  • Holm & Halby

    LAF kabinetter: Er du rustet til den nye EN12469 / Annex 1

  • Drifton

    Mød Drifton og DACOS på LabDays 2025 i Aarhus

  • DENIOS ApS

    Hvordan håndterer du noget, du ikke kan se?

  • Mikrolab – Frisenette A/S

    Vægtbytte er blevet opdateret: Nu får du flere muligheder

  • Busch Vakuumteknik A/S

    Busch Vacuum Solutions fremviser avancerede produkter fra Pfeiffer Vacuum+Fab Solutions på LabDays

  • Dansk Laborant-Forening/HK

    LABORANTER CAND.ALT.

  • Kem-En-Tec Nordic

    Lad os fortsætte traditionen – vi ses på LabDays!

Vis alle nyheder fra vores FOKUSpartnere ›

Seneste Nyheder

  • Vil du stå i spidsen for et af Danmarks ældste fagblade – Dansk Kemi søger ny redaktør

    17.09.2025

  • Jubilæumsudgaven af Labdays i Aarhus er kommet godt fra start

    10.09.2025

  • Kvantealgoritmer og kemisk forståelse i åbne systemer

    03.09.2025

  • Grøn kemi, affald og plast

    26.08.2025

  • Det gyldne mikrobiom: Tarmbakterier som kilde til det essentielle B-vitamin riboflavin

    20.08.2025

  • Antibiotikaresistens i vores naturlige miljøer

    12.08.2025

  • Nye metoder giver indsigt i plantebaseret strukturdannelse

    04.08.2025

  • Hofmeister – nem at anvende, svær at forstå

    23.06.2025

  • Udvinding af fødevareproteiner fra kløvergræs ved membranteknologi

    17.06.2025

  • Trinatriumhexafluo… hvad for noget?

    09.06.2025

  • Prisen på grisen: Hvad koster oprensning af beskidt CO2?

    02.06.2025

  • Der er brug for lange måleserier af miljøparametre

    26.05.2025

  • Chemical ionization mass spectrometry in atmospheric studies

    19.05.2025

  • Gamle processer, nye muligheder: Nyt kemisk-biologisk koncept til CO2-fangst og omdannelse

    14.05.2025

  • Centrotherm clean solutions bliver til Pfeiffer Vacuum+Fab Solutions

    14.05.2025

Alle nyheder ›

Læs Dansk Kemi online

Annoncering i Dansk Kemi

KONTAKT

TechMedia A/S
Naverland 35
DK - 2600 Glostrup
www.techmedia.dk
Telefon: +45 43 24 26 28
E-mail: info@techmedia.dk
Privatlivspolitik
Cookiepolitik