Helt unikke enzymer fundet i svampe åbner nye muligheder for den kemiske og farmaceutiske industri.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 11, 2012 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Lars H. Østergaard og Lisbeth Kalum, Novozymes A/S
En helt ny klasse af enzymer kan indsætte hydroxylgrupper på en række forskellige aromatiske, alifatiske og heterocykliske forbindelser ved tilsætning af enzym og hydrogenperoxid. Denne klasse af oxiderende enzymer giver en række nye anvendelsesmuligheder og kan eksempelvis anvendes indenfor biokatalyse eller ved produktion og udvikling af lægemidler.
Oxiderende enzymer
En del kommercielt tilgængelige industrielle enzymer falder i klassen af oxiderende enzymer, altså enzymer der er i stand til at katalysere en oxidation af et substrat.
Oxiderende enzymer kan inddeles efter, hvorvidt de anvender dioxygen eller hydrogenperoxid som oxidationsmiddel og yderligere efter, om oxygen indsættes i substratet (figur 1).
Oxidaser reagerer med dioxygen, som reduceres til hydrogenperoxid eller helt til vand. Oxygenaser anvender også dioxygen, men indsætter oxygen i substratet. Tilsvarende kan oxiderende enzymer, der benytter hydrogenperoxid som oxidationsmiddel, inddeles i peroxidaser og peroxygenaser:
Tidligere har peroxygenaseaktivitet kun været rapporteret som en del af helt specifikke enzymsystemer i f.eks. planter, men for nylig blev en helt ny gruppe af enzymer med peroxygenaseaktivitet isoleret fra svampe [1]). Disse peroxygenaser katalyserer hydroxylering og epoxidering af en meget bred vifte af substrater: Aromatisk hydroxylering af eksempelvis benzen eller naphthalen, hydroxylering af alifatiske forbindelser såsom heptan, epoxidering af eksempelvis styren og oxidation af heterocykliske forbindelser som dibenzothiophen og pyridin (figur 2). Denne nye gruppe af peroxygenaser har derfor fået navnet ”uspecifik peroxygenase”.
Tilsvarende bred substratspecificitet er ellers kun kendt fra cytochrome P450-systemer, som findes bundet i membraner i levende celler. De fungale peroxygenaser er derimod extracellulære enzymer, hvilket muliggør industriel produktion. Inkorporering af oxygen i substraterne betyder, at de får ændret egenskaber, som f.eks. vandopløselighed, reaktivitet og bionedbrydelighed, og åbner samtidig for en række anvendelsesmuligheder bl.a. indenfor biokatalyse.
Cofaktorer er hemmeligheden
De oxiderende enzymers aktivitet er afhængig af cofaktorer, en forbindelse som er i stand til at modtage og afgive elektroner. En cofaktor sidder bundet til enzymet og er enten en organisk forbindelse, såsom hæm, eller en uorganisk forbindelse, såsom metal-ioner. Jern er den mest udbredte metal-ion hos oxiderende enzymer, mens kobber, mangan og molybdæn er mindre anvendt [2].
Et af de vigtigste molekyler for liv er hæm. De fleste kender til molekylet i kraft af proteinet hæmoglobin, der transporterer dioxygen fra lungerne til andre organer og væv i kroppen. Det er hæm-molekylet, der giver hæmoglobin dets unikke oxygenbindende egenskaber. Men hæm er altså også en vigtig cofaktor i en række andre nøgle-proteiner og enzymer: Hæmoglobin og myoglobin transporterer og opbevarer dioxygen, cytochromer og oxidoreduktaser understøtter den cellulære energiproduktion og biosyntese, cytochrom P450’ere er vigtige for metabolisme af lægemidler og syntese af endogene forbindelser såsom steroider. Endelig findes hæm som cofaktor i en række industrielle enzymer, herunder peroxidaser (figur 3), katalaser og den nye peroxygenase.
Kommercielle anvendelser
De i dag kommercielt tilgængelige oxiderende enzymer anvendes indenfor en række forskellige industrier [3]. Oxidaser anvendes således indenfor bageindustrien, hvor glukose oxidaser oxiderer glukose under frigivelse af hydrogenperoxid, som øger krydsbindingerne i gluten. Kombinationen af en oxidase og en peroxidase findes i visse tandpasta, hvor den af oxidasen dannede peroxid dels virker blegende og dels indgår i et naturligt antibakterielt system sammen med peroxidasen [4]. Peroxidaser og katalaser anvendes ligeledes indenfor tekstilindustrien, hvor de benyttes til fjernelse af overskudsfarve og peroxid. Endelig benytter tekstilindustrien også oxidaser til blegning af farven indigo i produktionen af denim.
Potentiel industriel anvendelse af peroxygenaser
Peroxygenaser kan selektivt hydroxylere komplekse substrater, hvilket ellers er en stor udfordring i organisk syntese. Derfor er anvendelse indenfor biokatalyse en spændende mulighed. I dag anvendes biokatalyse i farmaindustrien i forbindelse med produktion og udvikling af nye lægemidler, men kun i mindre omfang i produktion af fin- og bulkkemikalier. Under udvikling af nye lægemidler skal man undersøge, hvordan disse omsættes i kroppen. Her kan en peroxygenase anvendes til at simulere den omdannelse af lægemidler som cytochrome P450 normalt katalyserer i leveren. To eksempler på hydroxylering af lægemidler er alkyl hydroxylering [5] af ibuprofen og aromatisk hydroxylering af dichlofenac (figur 4).
Phenol er blandt de 25 vigtigste kemiske produkter i verden med en årlig produktion på omkring 9 mio. tons. Phenol fremstilles industrielt primært ved ”cumene processen”. Benzen reagerer med propylen (alkylering ved 30 atm og 180-250°C), herefter oxideres det dannede cumene til cumene hydroperoxid som efter sur hydrolyse frigives som phenol og acetone.
Peroxygenaser kan overføre oxygen fra peroxid direkte til benzen, hvorved phenol kan fremstilles under milde betingelser med vand som biprodukt.
Anvendelse af peroxygenaser til biokatalyse giver en række fordele: Idet enzymerne er selektive kan man ofte reducere syntesevejen og undgå besværlig beskyttelsesgruppekemi. Der dannes færre biprodukter, og man kan opnå højere udbytter [6]. Endvidere foregår reaktionerne under milde betingelser, således at man opnår en miljømæssig fordel og kan reducere energiforbruget. At anvende peroxygenaser uden for deres naturlige vandige miljø byder dog også på en række procesmæssige udfordringer. Der stilles store krav til stabilitet overfor solvent, som ofte tilsættes for at øge substrattilgængeligheden. Desuden forbruges hydrogenperoxid i støkiometriske mængder i forhold til substratet. Da høje koncentrationer af hydrogenperoxid deaktiverer enzymet bør peroxid i de tilfælde tilsættes løbende under reaktionen.
Tillige vil anvendelser indenfor bioremediering være af interesse da peroxygenaser kan oxidere en række miljøfremmede stoffer som f.eks. polyaromatiske hydrocarboner, og herved øge bionedbrydeligheden.
Tak til EU-projekt Peroxicats (KBBE-2010-4-265397) for økonomisk støtte.
Referencer
Hofrichter, M. and Ullrich, R. (2010). New trends in fungal biooxidation. In: The Mycota (Hofrichter, M., ed.). 423-449. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Andreini, C.; Bertini, I.; Cavallaro, G.; Holliday, G.L. and Thornton, J.M. (2008). Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218.
Xu, F (2005). Applications of oxidoreductases: Recent progress. Industrial Biotechnology 1, 38–50.
Kussendrager, K. D. & van Hooijdonk, A. C (2000). Lactoperoxidase: physico-chemical properties, occurrence, mechanism of action and applications. Br J Nutr 84 Suppl 1, S19–25.
Poraj-Kobielska, M.; Kinne, M.; Ullrich, R.; Scheibner, K.; Kayser, G.; Hammel. K.E. and Hofrichter, M. (2011). Preparation of human drug metabolites using fungal peroxygenases. Biochemical Pharmacology. 82, 789-796
Hollman, F.; Arends, I.W.C.E; Buehler, K., Schallmey, A. and Bühler, B. (2011). Enzyme-mediated oxidations for the chemist. Green Chem., 13, 226-265.
Faktaboks. Hæm – en enzymatisk cofaktor
Den kemiske struktur af hæm
– Består af et jern atom bundet i centrum af et organisk molekyle kaldet porphorin.
– Hæm har både hydrofobe og hydrofile egenskaber, der gør det i stand til at binde til proteiner.
– Jern-ionen er koordineret af fire N-atomer, men kan binde yderligere to ligander (f.eks. O2 som i hæmoglobin).
– Cofaktoren kan også veksle mellem flere oxidationstrin (+2, +3 and +4), hvilket muliggør overførsel af elektroner og katalyse af redox-reaktioner.
Fotografi af svampen Marasmius rotula der producerer peroxygenase som led i sin katabolisme (© Dr. R. Ullrich, Internationales Hochschulinstitut, Zittau).
Figur 1. Oversigt over oxiderende enzymer og deres industrielle anvendelser.
Figur 2. Oversigt over peroxygenase reaktioner.
Figur 3. Repræsentation af krystalstrukturen af kloroperoxidasen (svampe peroxygenasens nærmeste kendte slægtning) med hæm bundet som cofaktor.
Figur 4. Eksempler på peroxygenase katalyseret hydroxylering af lægemidler: Alkyl hydroxylering af ibuprofen (A) og aromatisk hydroxylering af dichlofenac (B).
