Anvendt Molekylær Biologi (AMB), Mykologigruppen ved Biocentrum-DTU samt By og Byg har i forskningsrådsprojektet »Skimmelsvampe i vandskadede bygninger« samarbejdet om at udvikle en DNA-chipbaseret metode til detektion af de hyppigst forekommende skimmelsvampefamilier i bygninger.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 1, 2004 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Lars H. Pedersen, Pernille Skouboe, Poul Erik Høiby, Dorte Lauritsen, Ida Jørring og Kim Holmstrøm, Anvendt Molekylær Biologi, Bioteknologisk Institut (BI), Hørsholm
Der har inden for de seneste år fra medie- og myndighedsside været stor fokus på en række indeklimasager i såvel offentligt som privat byggeri – især vandskadede skoler har haft og har stadig stor bevågenhed. I 1997 førte indeklimaproblemerne til, at By og Byg og Arbejdsmedicinsk Klinik, Bisbebjerg Hospital sammen med en række institutioner og virksomheder fik bevilget et tværdisciplinært forskningsprojekt, der skulle belyse skimmelsvampeproblematikken i Danmark. AMB blev sammen med Mykologigruppen inddraget i en del af projektets hurtigmetodeudvikling, idet vi havde en omfattende komplementerende morfologisk og molekylær viden om skimmelsvampedetektion.
Detektion af skimmelsvampe
Skimmelsvampevækst forekommer ofte i forbindelse med vandskader på bygninger – f.eks. på tapeter. Tilkaldte eksperter kan ofte identificere skimmelsvampene på stedet, men der tages også tit aftryk af bygningsdelene på aftryksplader med vækstmedium. Aftrykspladernes svampe identificeres efterfølgende morfologisk af specialister inden for nogle dage eller uger.
Vi ønskede at udvikle en hurtig DNA-baseret metode, der kan bruges til hurtig identifikation på familie- eller artsniveau, og som er uafhængig af svampespecialister.
DNA-chip-metoden
Med udgangspunkt i en specifik region af skimmelsvampegenomet, som koder for strukturelle RNA-molekyler, der indgår i ribosomerne, kan man gruppere svampe efter slægt og i nogen tilfælde art (figur 1). Grupperingsmuligheden opstår, fordi store dele af de ribosomale molekyler er fælles for alle svampe (de blå regioner i figur 1), mens andre dele er variable (de grå områder = ITS regionen). Vha. PCR-teknologi er det muligt at amplificere ITS PCR-produkter fra alle svampe. PCR-produkterne fra sikkert identificerede svampearter/familer (f.eks. fra Mykologigruppens stammesamling eller andre internationalt anerkendte samlinger) sekvensbestemmes og anvendes til at gruppere svampene i databaser.
By og Byg og Mykologigruppen udvalgte en række bygningsrelaterede svampeslægter og -arter. En ITS-sekvensdatabase blev etableret, og den er udgangspunkt for valg af de prober, som vores bygnings DNA-chip er udstyret med (figur 2). Afsætning og immobilisering af prober på de mikroskopslideformede glas- eller polymerchips kører i dag rutinemæssigt ved AMB. Udfordringen i en PCR-produktanalyse er den specifikke opfangning af PCR-produktet på de immobiliserede prober. ITS-produktet indeholder en række DNA-sekvenser, der gør, at produktet kan folde op, og det har derfor krævet nogen indkøring at få opfangningen til at fungere optimalt.
Identifikation af svampe fra inficerede tapeter
Fra at have opfanget blandede PCR-produkter fra forskellige svampe simultant på den samme chip, lykkedes det at demonstrere den praktiske anvendelse af en bygnings DNA-chip. En række tapeter indsamlet af By og Byg blev udleveret til BI, der efterfølgende ekstraherede DNA fra tapeterne og amplificerede ITS-produkter. Figur 3 er et eksempel på, at det var muligt at identificere en ukendt svamp (Chaetomium spp) med denne metode, og det lykkedes efterfølgende med sekvensanalyse at bekræfte resultatet.
Status
Identifikation af en given art forudsætter naturligvis, at den/de nødvendige prober er til stede på chippen, og at der ikke sker krydsreaktioner til andre arter. Det er derfor nødvendigt at teste chippen over for en række slægter/arter som led i validering af metoden, og det er nødvendigt at teste, om det er muligt at ekstrahere DNA fra en række materialer/skrab fra materialer. Det skal endvidere understreges, at chipanalysen i sin nuværende form udelukkende er kvalitativ, men der arbejdes også med udvikling af kvantitative DNA-analyser.
Tidsmæssigt tager en DNA-analyse fra ca. 8-24 timer pga. reaktionerne, dog med en kort hands-on-tid, hvilket gør metoden meget konkurrencedygtig – især hvis flere prøver skal analyseres. Anvendelsesområderne for chippen er brede (alle svampe), men der fokuseres på indeklimaproblemer (ventilation) og bygningssvampe samt fødevarebårne svampe.
Tak til samarbejdspartnere
Suzanne Gravesen (By og Byg), Birgitte Andersen, Ulf Thrane, Kristian Fog Nielsen (Mykologigruppen, Biocentrum-DTU), Svend Erik Rasmussen (Teknologisk Institut). En mindre del af projektet var finansieret af Forskningsprogrammet »Skimmelsvampe i vandskadede bygninger«.
Figur 1 viser et meget lille udsnit af et svampekromosom. De blå områder er de ribosomale RNA-molekyler, der transskriberes og som indgår i ribosomerne, mens de grå områder er »intergenic transcribed spacers« (ITS), der udsplejses efter transskription. De blå områder er i store træk meget ens for alle svampe, mens de grå områder er variable og derfor egnede til familie- eller artsgruppering af svampene.
Med PCR-primere placeret i de blå områder (pile) amplificeres fluoroformærkede PCR-produkter som indeholder de variable zoner. PCR-produkterne kan sekventeres og benyttes til at konstruere en database over svampe. Databasen er udgangspunktet for konstruktionen af DNA-chips (figur 2).
Figur 2 viser princippet i en DNA-chip. En række forskellige DNA-prober (grønne pletter) dispenseres vha. en DNA-array robot og immobiliseres kovalent eller elektrostatisk. Efterfølgende kan mærkede PCR-produkter (gul farve) amplificeret fra ukendte svampekilder opfanges på en specifik probe, hvis der er komplementaritet mellem probe og PCR-produkt. Hvis et positivt signal (gult) fremkommer, indikerer det, at en given svamp (eller en tæt beslægtet) er til stede i prøven, hvorfra PCR-produktet er mangfoldiggjort.
Figur 3 viser resultatet af en DNA-chip analyse. DNA ekstraheredes fra et tapet (billedet til højre). Et PCR-produkt blev amplificeret som indikeret i figur 1 og søgt opfanget på DNA-chippen. På dette tapet lyser 4 spots op, svarende til at svampen på tapetet med stor sandsynlighed var en Chaetomium spp. Den hvide streg på DNA-chippen svarer til 500 µm. Pletterne til højre i billedet er optiske artefakter.
