Fastfase mikroekstraktion er en alternativ ekstraktionsmetode, der kan erstatte mange ekstraktioner med organiske opløsningsmidler.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 8, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Mogens T. Jensen, Danmarks JordbrugsForskning, Johnny W. Madsen, Analycen, og Lars Petersen, Aalborg Universitet Esbjerg
Fastfase mikroekstraktion (engelsk: Solid Phase MicroExtraction – SPME) er en relativ ny solventfri ekstraktionsteknik, der er ved at vinde indpas på mange laboratorier. Teknikken blev oprindeligt udviklet til ekstraktion af pesticider fra vand, men har siden vist sig at være velegnet til mange andre stofgrupper. Ved Afdeling for Animalske Fødevarer, Danmarks JordbrugsForskning, er der arbejdet med teknikken siden 1996, og SPME er anvendt til analyse af aromastoffer i kød og mælk. Derudover er metoden brugt til analyse af flygtige forbindelser i indholdet fra mave-tarmkanalen fra grise, gødning, bakteriekulturmedie, gyllelugt og staldlugt.
SPME-teknikken
Kernen i SPME er en tynd fiber coatet med et absorberende materiale. Det absorberende materiale varieres efter, hvilke forbindelser man ønsker at analysere. Fiberen er monteret i en beskyttende hul nål (figur 1). Der kan ekstraheres fra gas- eller væskefasen.
Ekstraktionen foregår ved, at nålen føres igennem septa på prøveflasken, fiberen skubbes ud af nålen og frilægges derved i prøven. Efter absorption i f.eks. 1 minut trækkes fiberen op i nålen igen, og nålen overføres til injektionsporten på gaschromatografen, hvorefter fiberen skubbes ud igen (figur 2). Pga. den høje temperatur i injektionsporten, typisk 250°C, frigøres forbindelserne, og resultatet er et ordinært chromatogram dog uden solventtop, som kendes fra væskeinjektion (figur 3).
Ekstraktionsteknikken kan anvendes til gaschromatografi (GC) eller højtryks-væskechromatografi (HPLC), dog primært til GC. Da ekstraktionen er solventfri undgås injektionstoppen i gaschromatogrammet. Det betyder, at injektionen kan foregå uden split, hvilket øger analysens følsomhed. Samtidig bliver forbindelser, som normalt er sammenfaldende med solventtoppen, detekterbare, hvilket er specielt værdifuldt ved letflygtige forbindelser.
Ekstraktion
Selve ekstraktionen bygger på ligevægte mellem væske- og gasfase og mellem gasfase og fiber. Dvs. at analyseoptimeringen bygger på særlig hensyntagen til disse ligevægte. Parametre som omrøring, temperatur, ekvilibreringstid, ekstraktionstid, fibertype, pH og saltkoncentration (vandaktivitet) i prøven har betydning for, hvor hurtigt ligevægtene nås.
I mange tilfælde indstilles ligevægtene aldrig i praksis, hvorfor man kan benytte sig af to forskellige teknikker: Korttids- eller langtidsekstraktion/ligevægtsekstraktion. De to metoder kan bedst forklares ved at se på en såkaldt »ekstraktionstidsprofil« (figur 4).
Det ses af figuren, at man ved kvalitative analyser ofte kan vælge en kort ekstraktionstid (i starten af profilen). Ønsker man at foretage kvantitative analyser, er det en fordel for præcisionen at vælge en lang ekstraktionstid på det flade stykke af profilen, hvor små udsving i ekstraktionstid har lille indflydelse på resultatet. Alternativt kan en kortere ekstraktionstid anvendes, men det kræver en omhyggelig kontrol af ekstraktionstiden, f.eks. vha. en autosampler.
Også frigørelsestid og temperatur i injektionsporten har en vis betydning. Ligger temperaturen af injektionsporten omkring fiberens maksimumtemperatur, er frigørelsestiden mindre vigtig.
Kvantificering
Kvantificering af flygtige forbindelser vha. SPME foregår som ved væskeekstraktion med opsætning af standardkurver. Et specielt problem ved SPME er fibrenes følsomhed over for organiske opløsningsmidler. Disse får coatingmaterialet til at svulme op, hvorved det skrælles af, når fiberen trækkes op i nålen. Da man som regel anvender organiske opløsningsmidler til opløsning af aromastoffer og andre flygtige forbindelser, kan fiberens følsomhed over for disse være et problem, idet det er problematisk at nå tilstrækkelig høj koncentration, når man forsøger at opløse stofferne i vand. Det er især et problem, hvis stofferne forekommer i høj koncentration i prøven.
Problemet kan løses ved at fortynde prøven eller ved at bruge et solvent til opløsning af standarderne, som har et lavt damptryk. Ved at anvende et opløsningsmiddel med et lavt damptryk undgår man at opløsningsmidlet giver en stor top i chromatogrammet. Tabel 1 viser udvalgte solventer med lavt damptryk og sammenligning med almindeligt anvendte solventer.
Kvantificering ved SPME bygger, som ved væskeinjektion, på standardkurver over de stoffer, der ønskes kvantificeret. Ekstraktionen behøver ikke nødvendigvis at være optimeret, så der er opnået ligevægt mellem alle faser. Men det er vigtigt, at ekstraktionsparametrene overholdes nøje ved alle ekstraktionerne, så der anvendes samme betingelser ved standarder og ved analyse af prøverne. Brug af intern standard og autosampler er en god ide.
Måling af oxidationsforløbet i kød
I cateringbranchen, der ofte bruger genopvarmning af tilberedt kød, er der problemer med uønsket dannelse af oxidationsprodukter. Her er aldehyddannelsen fra umættede fedtsyrer særligt markant og kan anvendes som indikatorer for oxidationsprocesserne. Figur 3 viser chromatogrammer af henholdsvis friskstegt og genopvarmet kød. Det genopvarmede kød har bl.a. markante toppe af aldehyderne pentanal og hexanal. Kvantificering af aldehyderne er derfor interessant i forbindelse med måling af oxidationsforløbet af fedtsyrerne i tilberedte kødprodukter. Figur 5 viser et eksempel på standardkurver af en serie homologe aldehyder i vand i koncentrationsområdet 0 til 1 ppm med følgende ekstraktionsbetingelser: 2 ml væske i en 10 ml prøveflaske tempereret til 40oC og ekstraktion med en polydimethylsiloxan/carboxenfiber i 10 sekunder. Korrelationen mellem koncentration og topareal er lineær, og kvantificering er derfor mulig, undtagen for pentanal, som viser en svag afbøjning ved den højeste koncentration.
Fremtidig brug af SPME
SPME-fibrene holder normalt til ca. 100 analyser, hvorefter de må kasseres. Med en pris på omkring 500 kr. pr. fiber er dette overkommeligt, da væskeekstraktionstrin helt kan undgås. SPME er, pga. den simple prøveforberedelse og mulig automatisering af ekstraktion og injektion med autosampler, særlig velegnet til screening af prøver for tilstedeværelsen af specifikke forbindelser.
Til indkøring og afprøvning af teknikken kan man for et mindre beløb anskaffe fiberholdere til manuel prøvetagning og injektion.
Kilder
Pawliszyn, J. 1997. Solid Phase Microextraction, Theory and Practice. Wiley, New York. 247 pp.
Pawliszyn, J. (Red.) 1999. Applications of Solid Phase Microextraction. The Royal Society of Chemistry Chromatography Monographs. Cambridge. 655 pp.
Internetadresse med applikationer med SPME
Opbygning af holder til SPME-fiberen
Holderen består af et stempel, hvorpå en nål er monteret. I spidsen af nålen er SPME-fiberen limet på. Fiberen er beskyttet af en hul nål, som anvendes til gennemboring af septa.
Arbejdsgang – aborptions- og desorptionsprocessen
Septa på prøvebeholderen gennembores af den hule nål, og fiberen skydes ud i gasfasen over prøven. Efter en passende absorptionstid trækkes fiberen op i nålen, og nålen trækkes ud af septaet. Ved frigøring af stofferne fra fiberen gennembores septa på gaschromatografens injektionsport, og fiberen skydes ud. På grund af den høje temperatur frigøres de absorberede forbindelser.
Figur 3.
Eksempel på chromatogrammer af aromaprofiler af henholdsvis friskstegt kød og genopvarmet kød
Tre gram tilberedt kød i tynde skiver i 10 ml prøveflasker ekvilibreres ved 65oC i 5 minutter. SPME-ekstraktion i 1 minut, derefter overførsel af SPME-fiber til gaschromatografens injektionsport for desorption.
Effekt af absorptionstid på topareal
En standardblanding blev ekstraheret med en SPME-fiber i et variabelt antal minutter og toparealerne plottet som funktion af ekstraktionstiden. Først efter mere end 300 sekunder begynder fiberen at komme i ligevægt med forbindelserne i luftfasen.
Standardkurver af aldehyder i vand
En serie standardblandinger af aldehyder i vand blev ekstraheret med en polydimethylsiloxan/carboxenfiber i 10 sekunder, hvorefter de analyseredes på en gaschromatograf.
