Ideen er, at de spektre, der skal analyseres med kemometriske metoder, skal indeholde så lidt irrelevant information som muligt.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 1, 2009. Teksten kan desuden læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Søren Balling Engelsen, Rasmus Bro & Lars Nørgaard, Institut for Fødevarevidenskab, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet
Ved spektroskopiske målinger vil der ofte forekomme lysspredningseffekter, der manifesterer sig i de resulterende spektre. Disse effekter indeholder ikke-kemisk information. Specielt i det nærinfrarøde omåde (780-2500 nm) er lysspredningseffekter betydelige og mangfoldige, fordi bølgelængderne for den nærinfrarøde stråling vekselvirker med partikel/organel-størrelser i de målte prøver. Ved diffus reflektans/transmittans spektroskopi vil lyset blive reflekteret og transmitteret, når det refraktive indeks ændres. Dette vil typisk ske, når lyset møder en partikel eller dråbe i et pulver eller emulsion. Det spredte lys fra prøven vil derfor blive en funktion af to egenskaber: (1) antallet af faseovergange som lyset gennemgår afhængigt af f.eks. dråbernes og partiklernes størrelse og form samt (2) de faktuelle forskelle i refraktiv indeks af materialerne i prøven og prøvematricen. Der vil f.eks. altid være mere lysspredning ved små partikler end ved større partikler. Der vil også være mere lysspredning, jo mere forskellig prøvematricens refraktive indices er. Det klassiske eksempel er den knuste grønne flaske Tuborg nede i den lokale pub. Når de knuste glasskår/partikler er store, er de stadig tydeligt grønne (analogt til kemisk information), men når glasskårene bliver fuldstændigt knust vil de blive mælkehvide (lysspredningen skjuler altså den underliggende kemi). Heldigvis findes der nogle effektive og meget simple metoder til fjernelse af disse lysspredningsfænomener: anden afledede spektre og multiplikativ skatter-korrektion (MSC). Disse metoder forsøger matematiske at fjerne eller reducere lysspredningseffekter i de målte spektre. Hensigten er at fjerne uønskede interferenser inden kalibrering og det forventede resultat er mere simple multivariate modeller. Hvis lysspredning er ukorreleret til den ønskede responsvariable, hvilket vil være tilfældet for de fleste kemiske konstituenter, så vil det være en god strategi. Der eksisterer imidlertid også tilfælde, specielt i det nærinfrarøde område, hvor lysspredningseffekterne netop er det, man ønsker at korrelere til. Det kunne f.eks. være, når man er interesseret i partikelstørrelsen. Det skal også nævnes, at det kan være en betydelig fordel for den visuelle fortolkning at få de analyserede spektre renset for lysspredningseffekter.
Vi vil i denne klumme se på de to udbredte forbehandlingsteknikker for ”forøgelse” af den kemiske information: anden afledte og MSC og på, hvorledes disse transformationer påvirker spektrene.
Spektrale afledede
Den første som vi vil se på er anden afledte spektre, der som forbehandlingsteknik er tudsegammel og blev benyttet intensivt af Karl Norris – en af pioneererne inden for nærinfrarød analyse af fødevarer og fødevareingredienser [1]. Figur 1 viser fordelene ved at tage spektrale afledte. I figur 1A har vi konstrueret et gaussformet single peak spektrum (sort), tilsat det samme spektrum et offset Y(blå)=Y+b og tilsat både et offset og en linear trend Y(rød)=a×Y + b. Hvis man derefter tager den første afledte af disse spektre Y’ (figur 1B), så vil to af de tre spektre blive identiske – kun det spektrum med både offset og lineær trend afviger nu med et offset. Gentager man proceduren – altså tager de anden afledte af de oprindelige spektre Y” (figur 1C), så bliver resultatet, at alle tre spektre bliver ens. Man har således opnået, at den spektrale information er blevet renset for både offseteffekter og lineære trend. Endvidere har anden afledte spektre den fordel, at de øger den visuelle opløsning i spektrene og har peaks ved samme position som de oprindelige spektre, dog med modsat fortegn. Derfor vil man i litteraturen nogle gange opleve, at de afbildede spektre er ganget med minus én (dette fortegnsskift har naturligvis ikke betydning for efterfølgende multivariate kalibrering).
Nærinfrarøde spektre
For at illustrere hvordan anden afledte og MSC influerer på målte spektre har vi udvalgt nogle få NIR-spektre af citruspektinpulvere, der spænder over en meget stor variation i esterificeringsgrad (DE). Esterificeringsgraden er afgørende for funktionaliteten af pektin. Højt methoxylerede pektiner danner geler ved sur pH ved tilstedeværelse af sukker, og esterificeringsgraden (DE) kontrollerer geleringskinetikken. Gelegenskaberne af lav-methoxy-pektiner er afhængig af tilstedeværelsen af divalente kationer som f.eks. calcium og er meget mindre pH-afhængig end for de højt methoxylerede pektiner. Ved de lavt foresterede pektiner er DE den primære parameter til kontrol af deres calciumreaktivitet. For at illustrere forbehandlingen af spektre har vi medtaget syv forskellige NIR-spektre af pektinpulvere med henholdsvis 0, 7, 22, 45, 60, 75 og 93% DE (figur 2A). I princippet indholder spektrene de samme polymerer blot med forskellig forestringsgrad og med forskellig partikelsammensætning.
Inspektion af NIR-spektrene giver os med det samme et hint om, at det er den lille kombinationstop ved 2244 nm (karbonyl C=O-strækning + methyl C-H-strækning), der kovarierer stærkt med esterificeringsgraden. Det er imidlertid lige så klart, at hvis man plotter DE mod absorbtionen ved 2244 nm, så får man ikke en særlig god korrelation (figur 2C). Hvis man i stedet beregner de anden afledte af de rå NIR-spektre, så får man tilsyneladende fremkaldt en meget stærkere korrelation (figur 2B). Nu er der tydeligvis god sammenhæng mellem intensiteten af 2244 nm peaken og DE (figur 2D). Som nævnt ovenfor er denne korrelation negativ. Når peaken ved 2244 nm stiger, så falder intensiteten af de anden afledte. Man kan sige, at man ved de spektrale anden afledte har fjernet lysspredningsfænomener og fremkaldt den kvantitative kemiske information. Vi vil ikke her komme ind på nærmere detaljer om, hvorledes man tager de anden afledte af spektre, men blot understrege, at der findes effektive numeriske metoder til at løse dette problem, og at en af de mest populære er Savitzky-Golay [3]. Generelt kan det anbefales at inspicere de afledte spektre, specielt for at sikre at støjen ikke er blevet forstørret.
MSC
Vi vil nu se på en anden meget populær metode til at fjerne lysspredningseffekter på – nemlig multiplikativ skatter-korrektion (MSC) [4]. Denne metode blev udviklet af Harald Martens og medarbejdere og er stærkt inspireret af klassisk Kubelka-Munk-teori. MSC-metoden er måske bedst motiveret ved at se på plot af de spektrale variable for individuelle spektre mod de spektrale variable for et gennemsnitsspektrum (figur 3A). Vi observerer, at de spektrale variable for hvert spektrum ligger tæt på regressionslinjen. Afvigelser i hældningen for regressionslinjen ift. target-linjen kan opfattes som forskelle i lysspredningen for prøven, mens afvigelser fra regressionslinien kan opfattes som kemisk information. Det faktum, at regressionslinjen kræver et offset for at blive fittet præcist, indikerer endvidere, at der i prøven ikke bare findes multiplikative lysspredningseffekter, men også additive lysspredningseffekter. MSC-modellen kan skrives som følger for ét spektrum:
Hvor b0 (offset i figur 3A) og b1 (hældning i figur 3A) er de to lysspredningskoefficienter. x , xmean og xcorr er det originale spektrum, et gennemsnitsspektrum og det korrigerede spektrum. I det originale arbejde af Martens og medarbejdere blev det foreslået, at lysspredningskoefficienterne blev estimeret fra et mindre spektralt område, hvor der ingen kemisk information er. Dette er virkelig et godt forslag, men for specielt NIR-spektroskopi er det umuligt at finde et sådan tomt spektralt område. I praksis findes lysspredningskoefficienterne ved brug af hele spektret. Det har endvidere den fordel, at MSC bliver brugerneutralt (objektivt). Et andet vigtigt aspekt ved MSC er definitionen af reference spektret xmean. Da det typisk er vanskeligt at vælge et velegnet referencespektrum bruges gennemsnitsspektret ofte.
Når vi ser på de MSC-korrigerede pektinspektre i figur 3B, er det indlysende, at vi ikke bare har bevaret den spektrale karakter af vores spektre, men vi har også fået fremkaldt den kemiske information ved 2244 nm. Hvis vi plotter intensiteten af peaken ved 2244 nm mod DE for de syv pektiner fås en ret korrelationslinje (figur 3C). Tydeligvis har vi forøget den kvantitative information i spektrene. Er man usikker på, om man har ”skyllet babyen ud med badevandet” ved MSC-forbehandlingen, kan det være et trick at inkludere de to ekstra variable: b0 og b1 til alle de spektrale variable inden kalibrering.
Outro
Ud fra et multivariat kalibreringsmæssigt syn har MSC-forbehandlingen to vigtige konsekvenser: (1) den simplificerer kalibreringsmodellen og (2) den øger lineariteten mellem spektrene og responsvariablen. I den næste klumme vil vi se på, hvordan man validerer antallet af latente faktorer, som benyttes til en PLS-model, og hvorledes MSC-transformationen kan simplificere en kalibreringsmodel.
Referencer
1. Near-Infrared Technology in the Agricultural and Food Industries (Eds. Williams and Norris), The American Association of Cereal Chemists, Inc., St. Paul, Minnesota, US, 1996 (ISBN: 0-913250-49-X). T.H. Begley, E. Lanza,E.,K.H. Norris and W.R Hruschka, W.R., Determination of sodium chloride in meat by near-infrared diffuse reflectance spectroscopy, Journal of Agricultural and Food Chemistry (1984), 32, 984-987
2. S.B. Engelsen, E. Mikkelsen and L. Munck, New approaches to rapid spectroscopic evaluation of properties in pectic polymers, Progr. Colloid Polym. Sci. (1998), 108, 166-174.
3. A. Savitzky and M.J.E. Golay, Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry (1964), 36, 1627-1639. J. Steinier, Y. Termonia and J. Deltour, Comments on smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedure, Analytical Chemistry (1972) , 44,1906 – 1909.
4. P. Geladi, D. McDougall and H. Martens, Linearization and scatter correction for near-infrared reflectance spectra of meat. Applied Spectroscopy (1985), 39, 491-500
Figur 1. Illustration af hvorledes spektrale afledede kan afhjælpe additive og multiplikative effekter i råspektre. (A) et single peak spektrum, et single peak spektrum plus et offset og et single peak spektrum plus et offset og en lineær tendens. (B) første afledede af (A). (C) anden afledede af (A).
Figur 2. (A) Syv pektin NIR-spektre (1100-2500 nm) med varierende esterificeringsgrad. Syv pektin anden afledede NIR-spektre (1100-2500 nm) med varierende esterificeringsgrad. (C) Skatterplot mellem esterficeringsgraden for de syv pektiner og absorbansen ved 2244 nm. (D) Skatterplot mellem esterficeringsgraden for de syv pektiner og signalintensiteten for de anden afledede spektre ved 2244 nm.
Figur 3. (A) MSC skatterplot, hvor de spektale variable for et tilfældigt spektrum er plottet mod de spektrale variable for et gennemsnitsspektrum. (B) Syv pektin MSC-korrigerede NIR-spektre (1100-2500 nm) med varierende esterificeringsgrad. (C) Skatterplot mellem esterficeringsgraden for de syv pektiner og den MSC-korrigerede absorbans ved 2244 nm.
