Vore forfædre udnyttede i langt højere grad end vi planternes naturlige antimikrobielle stoffer til konserveringsformål af bl.a. fødevarer. På BioCentrum-DTU har man studeret den antimikrobielle effekt af ekstrakter fra planter og urter, og det er vist, at visse stoffer er effektive i næsten smagsløse doser.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Per Væggemose Nielsen, og Karin Isabel Suhr, ph.d.-studerende i Mykologigruppen, Sektion for Levnedsmiddelbioteknologi og Mykologi, BioCentrum-DTU, DTU
Mennesker har gennem tusinder af år lært at leve af og med naturen og udnytte de forhåndenværende plantematerialer. Dele af den viden har overlevet i form af »naturmedicin« og »gode husråd«, mens meget i dag er gået tabt eller ikke udnyttes. Moderne tænkning i miljørigtige »grønne« produktionsmetoder og negative forbrugerholdninger til kunstige tilsætningsstoffer giver perspektiver for at (gen)indføre stoffer udvundet fra planter til erstatning for syntetisk fremstillede konserveringsmidler. Her fokuseres på anvendelsen af ekstrakter fra krydderier og krydderurter til sikring af en optimal fødevarekvalitet.
Planternes »kemiske værn«
Sekundære metabolitter, som produceres af planter, menes at være deres kommunikation med omverdenen. Iblandt dem regnes f.eks. forsvarsstoffer, som planterne har udviklet for at forhindre invasion af fjender som svampe og bakterier, insekter eller større dyr. Der er ingen tvivl om, at vore forfædre udnyttede planternes naturlige antimikrobielle stoffer i lang højere grad, end vi gør i dag. De tidligste kilder viser anvendelsen af planter og krydderier ved balsameringen af ægyptiske mumier omkring 2600 år før vor tidsregning, [1] og brug af sennepsfrø til konservering af frugtsaft i Romerriget [2]. I primitive samfund menes krydderier og krydderurter at have været brugt i lige så høj grad for deres antimikrobielle virkninger, som for de smagsgivende egenskaber. Ganske som saltning er en gammelkendt konserveringsmetode, kan krydderier og krydderurter have haft en tilsvarende funktion [3]. I dag kender vi bedst stofferne pga. deres smagskarakteristika, og brugen af dem er i nogle tilfælde blevet traditionsbunden skik. F.eks. menes humle oprindeligt at være blevet tilsat øl pga. de antimikrobielle indholdsstoffer (humuloner, lupuloner), og den bitterhed humlen forårsagede var en uønsket bivirkning. Med tiden er bitterhed så blevet en vigtig karakter for øl, der nødvendiggør brugen af humle [4].
Det er også et kendt faktum, at stærke krydderier traditionelt anvendes langt hyppigere og i større doser i varme udviklingslande (hvor køleskabe ikke er hver mands eje). Her er det en fordel, at de aktive antimikrobielle stoffer ofte også er aromastoffer, så man kan smage om maden er tilstrækkeligt konserveret. En omfattende undersøgelse af knap 5.000 kødbaserede madopskrifter fordelt på alle kontinenter fandt en positiv korrelation mellem middeltemperaturen i landet og brugen af stærke antimikrobielle krydderier, som cayennepeber, hvidløg, løg, anis, kanel, koriander, kommen, ingefær, citrongræs og gurkemeje [3]. Mens brugen af persille og dild er omvendt korreleret til middeltemperaturen. Til gengæld var der ingen forskel på antallet af krydderurter, som voksede naturligt i de forskellige lande. Det bekræfter, at der anvendes en større del af de forhåndenværende krydderurter og krydderier i varmere lande. I den »den primitive« madlavning efterleves endvidere ofte den tommelfingerregel, at kombinationskonservering med flere stoffer er at foretrække frem for et enkelt stof. Et eksempel er den unikke og specifikke »curry«-blanding, der ofte er husstandens særeje i Indien. Brug af flere stoffer giver et bredere antimikrobielt spektrum og forebygger udvikling af resistensmekanismer hos mikroorganismer.
Krydderier og krydderurter
De virksomme stoffer i planterne findes ofte i den essentielle oliedel. Foruden disse stoffer, som almindeligvis dannes i hele planten og udgør en del af den almindelige funktion og metabolisme, kan mere specifikke stoffer dannes af planten, som reaktion på stress, mikrobielt angreb o.l. Disse inducerede stoffer er som regel større molekyler, som phytoalexiner og andre polyphenoler. Mange af dem har også antimikrobiel aktivitet, men er mindre undersøgte mht. virkning end de mindre stoffer i den essentielle olie.
Et udvalg af de mest kendte urter og krydderier samt eksempler på deres aktive antimikrobielle komponenter er listet i tabel 1 og vist i figur 1. De aktive stoffer her er hovedsageligt terpener (f.eks. carvon, limonen) eller phenolholdige forbindelser (eugenol, kanelaldehyd, vanilin). Små svovlholdige molekyler som allicin fra hvidløg og isothiocyanater fra sennep (og andre »korsblomstrende« planter) hører også til i kategorien af små flygtige effektive antimikrobielle naturlige forbindelser.
I dag anser vi mest krydderier som værende aromastof-afgivere, men adskillige forsøg har vist hæmmende eller dræbende effekt på bakterier, gær og skimmelsvampe af indholdsstofferne [5-7]. Enkelte steder i vores hverdag kan man stadig støde på brug af disse naturlige stoffer i antimikrobiel henseende, eksempelvis er det ved syltning af rødbeder et gammelt husråd at lægge et stykke peberrod (som indeholder store mængder allylisothiocyanat) med ned i glasset, og hos tandlægen kan man finde nellikeolie (eugenol) brugt mod tandpine.
De aktive stoffer er ikke lige virksomme over for forskellige mikroorganismer (forskellige antimikrobielle spektra), og mikroorganismernes følsomhed afhænger af hvilket stof, som undersøges. Svampe synes generelt at være mere følsomme end bakterier, og Gram negative bakterier synes at være mere resistente end Gram positive [8]. Forskellige testprocedurer i litteraturen gør det dog svært at sammenligne forskellige resultater direkte med hinanden.
Studier af specifikke virkningsmekanismer for de aktive stoffer er sparsomme. Fælles for de phenolholdige stoffer synes dog at være en skadelig påvirkning af cellemembran [9], og ødelæggende virkning på enzymer er blevet påvist for de små svovlholdige forbindelser [10].
Aktiv pakning
I forbindelse med en række samarbejdsprojekter med den danske mejeribranche, danske brødfabrikker og emballagevirksomheder har vi undersøgt mulighederne for at pakke levnedsmidler under modificeret atmosfære for derigennem at forhindre skimmelvækst på produkterne og sikre en bedre produktkvalitet. Pakning i modificeret atmosfære med meget lave oxygen-niveauer (<0,2%) og høje kuldioxidniveauer kan sikre en længere holdbarhed men kan i flere tilfælde ikke helt stoppe væksten. Nogle gær kan endda give problemer, selvom al oxygen er fjernet med en oxygen-absorber.
Da modificeret atmosfære i flere tilfælde ikke giver en tilstrækkelig konserverende effekt, er mulighederne for at benytte aktiv pakning undersøgt. Ved aktiv pakning har pakken en ekstra (aktiv) funktion ud over blot at være et (passivt) beskyttende lag mod omgivende miljø. Pakningen kontrollerer eller kan reagere på fænomener inde i pakken [11]. De mest gængse former for aktiv pakning har været at indlægge eller indbygge oxygen-absorbere i emballagen. Andre tiltag har været forskellige indikatorer som ved en farvereaktion kan vise, om produktet er nået ud over sin holdbarhedsperiode. På Biocentrum-DTU er brugen af ekstrakter fra krydderier og urter som aktive komponenter i forbindelse med emballering undersøgt. Især de flygtige antimikrobielle stoffer har været i fokus, fordi de ikke kræver direkte kontakt mellem produkt og emballagen, og samtidig virker hvor der er behov for dem, nemlig på overfladen af produktet.
Indledningsvis blev der foretaget et screeningsforsøg på fast laboratoriemedie. Her blev en række alkoholer og flygtige olier testet mod de mest hyppigt fundne gær og skimmelsvampe på brød [12]. Figur 2 viser resultaterne fra et forsøg, hvor der blev tilsat 100 ml af de forskellige alkoholer på et lag filterpapir i låget af en petriskål podet med de forskellige svampe og forseglet med parafilm. Det ses, at den relative hæmning efter 14 dage stiger med kædelængden af alkoholen, således har ethanol, 2-propanol og tert-butanol nogenlunde den samme effekt, mens pentanol hæmmer væksten fuldstændig.
Figur 3 viser resultaterne fra et tilsvarende forsøg med krydderiekstrakter hvor der blev tilsat 1 ml til hver petriskål. De viste fuldstændig hæmning af mikroorganismer ved brug af sennep, en kraftig hæmning ved brug af kanel, hvidløg og nellike, men kun lille effekt for oregano og vanille [12].
På baggrund af resultaterne afprøvede vi sennep, kanel og nellike i et pilot-pakkeforsøg med brød, hvor vi forinden podede brødene med svampe/gær1 og doserede olien i petriskåle, der blev pakket sammen med brødene uden at have direkte kontakt.
Disse forsøg viste, at sennepsolie var særdeles effektivt, hvorimod de to andre olier skulle op i meget store mængder, som antageligt var sensorisk uacceptable i et så følsomt produkt som brød. Derfor fortsatte vi med at fokusere på sennepsolie.
Senneps essentielle olie
Det aktive stof i sennepsolie er allylisothiocyanat (AITC), som udgør helt op til 95% af olien. AITC dannes ud fra glucosinolater, som findes oplagret i vakuoler inde i plantecellerne. Når cellerne knuses eller går i stykker, kommer glucosinolaterne i kontakt med enzymet myrosinase, som spalter det til AITC og andre produkter
I vores undersøgelser fandt vi, at Aspergillus flavus var den svamp, som krævede højst sennepsoliedosis for at blive hæmmet. Men ved at kombinere sennepsolien med MAP, var det muligt at hæmme svampen, når der blev anvendt en sensorisk acceptabel dosis af sennepsolie. Yderligere forsøg med hvedebrød har dog vist, at dosis skal omkring eller over den sensoriske kritiske grænse (2 µl/brød) for at hæmme gær i MAP-pakket hvedebrød.
Derimod var det muligt at hæmme alle undersøgte skimmelsvampe og gær på rugbrød i en sensorisk acceptabel dosis (ca.1 µl/1000 ml luft/brød). Rugbrød er dog også væsentligt forskelligt fra hvedebrød med bl.a. meget lavere pH og mere »egensmag«.
De lovende resultater med anvendelse af AITC til konservering har gjort, at vi er gået videre med at få indbygget stoffet i fødevareemballage. Det sker bl.a. i EU-projektet BioPack ( http://www.biopack.org ), hvor vi vil indbygge aktive komponenter i bionedbrydelige film fremstillet af polylactat og poly-3-hydroxy-butyrat. Stofferne bygges først ind i cyclodextriner, som dels beskytter under indbygningen i polymeren, dels sørger for en kontrolleret frigivelse af stofferne.
Som nævnt benyttede de gamle romere sennep/AITC til konservering. I dag findes en række patenter på forskellige applikationsmetoder, hvor AITC anvendes som aktivt antimikrobielt stof. De er især af japansk eller amerikansk oprindelse. AITC er godkendt som aromastof i EU (opført i »den blå bog«), som et kategori A stof og en TDI (tolerabelt dagligt indtag) på 3,6 mg/dag/person. Til sammenligning skal nævnes, at i Dijon sennep findes omkring 0,22% AITC svarende til ca. 11 mg i en teskefuld (Moutarde de Dijon, Eldorado). Men da stoffet ikke er godkendt og optaget i positivlisten som et konserveringsmiddel, kan det ikke anvendes som sådan. Det vil i givet fald kræve en godkendelse i EU-systemet [12].
Har fasen betydning?
Resultaterne fra forsøgene med antimikrobielle stoffer fra krydderier og urter er på sin vis i modstrid med de resultater, der findes i litteraturen, og som vores samarbejdspartner i EU har fundet. Sennep findes således langt nede på listen over de mest antimikrobielle planter. Men da mange af forsøgene er udført ved at tilsætte stofferne til produktet blev betydningen af, om stoffet var i gasfase eller tilsat produktet undersøgt. I en forsøgsopstilling tilsattes derfor den samme mængde stof enten til vækstsubstratet eller til gasfasen over substratet (i begge tilfælde hhv. 125 og 250 ml/ml).
Figur 4 viser et PLS-r model over hæmning, afhængig af hvilket stof der tilsættes. På plottet ses det, at det er forskellige stoffer, der hæmmer svampene i de to systemer (mærket med røde ringe). De stoffer, som virker bedst i det flygtige system, ligger forneden i plottet, mens de der virker bedst, når de bliver tilsat mediet, ligger foroven. Jo længere stofferne ligger mod højre i plottet, des mere aktive er de. Stofferne mærket med A (sennep, citrongræs og timian) virker godt i begge systemer. Timian, nellike og kanel virker godt, når de tilsættes mediet (B) og appelsin, rosmarin og salvie (C) virker godt, når de tilsættes i gasfasen. Sammenholdes figur 4 med tabel 1 og figur 1 ses, at de ekstrakter, der virker bedst ved tilsætning til mediet (B), hovedsageligt består af phenoliske stoffer. Det er også disse stoffer, som i litteraturen angives som de mest antimikrobielle komponenter i planteekstrakter efterfulgt af aldehyder, ketoner, alkoholer og andre hydrocarboner. Sennep og citrongræs virkede godt i mediet, men virker bedre som flygtige stoffer, faktisk var sennep effektiv selv ved 1 ml/ml i gasfasen. Grunden til den store forskel i aktivitet er sandsynligvis, at allylisothiocyanat ved tilsætning til mediet reagerer med proteinerne i mediet og bliver delvist inaktiveret.
Perspektiver for naturstoffer
Sekundære metabolitter i vore fødeplanter er noget, som pr. tradition ikke har haft stor interesse. De er som regel blevet minimeret eller ignoreret gennem avlsarbejde. I nyere tid er interessen dog blevet skærpet for stofferne, som følge af den jagt man har drevet for at finde en forklaring på det industrialiserede samfunds velfærdssygdomme (som sukkersyge, hjertekar-sygdomme og kræft). I den sammenhæng har de naturlige aktive stoffer fået tillagt (ny) stor betydning, og man har skelet kraftigt til isolerede natur-/stammefolk, hvor »medicin« og føde ikke rigtigt skelnes fra hinanden [13]. Antioxidanter er nu almindelig kendt for at have en forebyggende virkning på kræft og hjertekar-sygdomme. Mange af disse antioxidanter er netop de samme (specielt phenol-forbindelser), som er blevet nævnt ovenstående for deres antimikrobielle egenskaber (figur 1).
Det giver et perspektiv for disse stoffer i den fremtidige levnedsmiddelproduktion, som både antimikrobielle og antioxidative stoffer. Der findes ganske givet også naturlige stoffer, som ikke har så kraftige smagsvirkninger, men stadige er antimikrobielle og antioxidative.
Den fornyede interesse har givet mange teorier inden for området, specielt for hvordan deres funktion er i relation til den menneskelige krop. Nogle hævder, at de stoffer man p.t. anser for ønskede (f.eks. anthocyaniner) måske kun er markørstoffer for de virkelig aktive og interessante stoffer. Eller i virkeligheden er deres virkning »skadelig«, hvilket er godt, da en lille dosis skadelige stoffer er ønskeligt, fordi det booster kroppens forsvarssystem, så det selv er »kampdygtigt«.
Fordi vi ikke fuldt ud kender de specifikke reaktionsmekanismer, findes der ikke nogen endegyldig teori. Den manglende viden vanskeliggør også arbejdet med at teste mange af stofferne og give vejledning til lovgivere på området, da det er svært at vurdere om testmetoden overhovedet er relevant og realistisk. En sådan situation leder f.eks. til paradokset omkring AITC. Stoffet er i en undersøgelse blevet fundet at være kræftfremkaldende i rotteleverceller, men samtidigt bliver netop glucosinolatholdige grøntsager anbefalet specielt mod kræft pga. beviser for forebyggende virkning. Dette paradoks bunder sandsynligvis i rette dosis-respons-forhold.
Vanskelighederne ved at teste de aktive naturlige stoffer i et passende system, og de dermed forbundne økonomiske omkostninger, er formodentlig en af bevæggrundene til, at de endnu ikke har været benyttet i udstrakt grad i levnedsmiddelindustrien. Men den øgede fokus på sundere fødevarer vil formodentligt være et incitament til at kigge nærmere på dem i fremtiden.
1) Hvedebrød blev podet med: Penicillium commune, P.solitum, Aspergillus flavus og Endomyces fibuliger. Rugbrød med: P.roqueforti, P.corylophilum, Eurotium repens og Endomyces fibuliger.
Referencer
1. David, A.R., 1992. Plants and plant products used in mummification, i H.N.Nigg & D.Seigler; Phytochemical Resources for Medicine and Agriculture, Plenum Press, New York, USA, s.15-32
2. Holm, F. 1999. Natural food preservatives. Antimicrobials, Report for The Nordic Minimal Processing Network, FoodGroup Denmark.
3. Billing,J & Sherman, P.W, 1998. Antimicrobial functions of spices: Why some like it hot. The Quarterly Review of Biology, 73, 1, 3-49.
4. Walker, J.R.L., 1994. Antimicribial Compounds in Food Plants, i V.M.Dillon & R.G.Board; Natural Antimicrobial Systems and Food Preservation, CAB Inetrnational, UK, s.181-204.
5. Deans, S.G. & Ritchie, G. 1987. Antimicrobial properties of plant essential oils, International Journal of Food Microbiology, 5, 165-180.
6. Gould, G.W., 1996. Industry Perspectives on the use of natural antimicrobials and inhibitors for food applications, Journal of Food Protection, supplement, 82-86.
7. Del Campo, J., Amiot, M. & Nguyen-The, C. 2000. Antimicrobial effect of rosemary extracts, Journal of Food Protection, 63, 10, 1359-1368.
8. Zaika, L.L., 1987. Spices and herbs: Their antimicrobial activity and its determination, Journal of Food Safety, 9, 97-118.
9. Nychas,G.J.E., 1995. Natural Antimicrobial from Plants, i G.W. Gould; New Methods of food preservation, Blackie, Chapman & Hall, UK, s.58-89.
10. Delaquis,P.J. & Mazza,G., 1995. Antimicrobial properties of isothiocyanates in food preservation, Food Technology, 11, 73-84.
11. Fabech et. al., 2000. Active and Intelligent Food Packaging, TemaNord 2000:584 , Nordic Council of Ministers, DK-København.
12. Nielsen, P.V. & Rios,R., 2000. Inhibition of fungal growth on bread by volatile components from spices and herbs, and the possible application in active packaging, with special emphasis on mustard essential oil, International Journal of Food Microbiology, 60, 219-229.
13. Johns, T. & Chapman, L., 1995. Phytochemicals ingested in traditional diets and medicines as modulators of energy metabolism, i J.T. Arnason et al.; Phytochemistry of medicinal plants, Plemun Press, New York, USA, s.161-188.
Figur 1. Antimikrobielle stoffer i udvalgte krydderier og urter.
Figur 2. Relativ hæmning efter 14 dage ved 25°C af de hyppigst forekommende skimmelsvampe på brød inhiberet ved tilsætning af 100 µl af forskellige alkoholer.
Figur 3. Relativ hæmning efter 14 dage ved 25°C af de hyppigst forekommende skimmelsvampe på brød inhiberet ved tilsætning af 1 µl essentiel olie (af sennep, kanel, hvidløg, nellike, oregano og vanille).
Figur 4. PLS-r plot over hæmning af svampevækst på rugbrød enten ved tilsætning af ekstrakter til mediet eller i flygtig form.
