Antallet af terapeutiske proteiner produceret i mammale celler er stærkt stigende. En bedre forståelse af processer baseret på mammale celler har derfor stigende industriel interesse, specielt set i lyset af hvor velrepræsenteret den biofarmaceutiske industri er i Danmark.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 10, 2007 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Jørn Meidahl Petersen, Bjarne Rask Poulsen, Claus Kristensen og Lars Højlund Christensen, Biopharmaceuticals Research Unit, Novo Nordisk A/S
Mammale celler er produktionssystem for en række proteinbaserede lægemidler, der er bragt på markedet gennem de seneste årtier. Således er andelen af terapeutiske proteiner produceret i mammale celler steget fra 15% til over 50% igennem de sidste 25 år [1]. Det øgede behov for glykoproteiner, såsom antistoffer, der bruges i høje terapeutiske doser, er en udfordring for eksisterende mammalcelle-produktionsteknologier. Det årlige forbrug af et terapeutisk protein kan variere fra mindre end 100 g til mere end 100 kg, og udbyttet målt som proteinkoncentration i cellekulturen varierer fra omkring 1 mg/l til omkring 5 g/l. I praksis betyder det, at der opereres med batchstørrelser af cellekulturer fra 100 L op til 20.000 L i den biofarmaceutiske industri. Disse volumener kulturvæske kan tilvejebringes gennem et meget stort antal små kulturer eller ved at skalere processen op til den ønskede batchstørrelse. Begge strategier benyttes, og mellemløsninger, hvor et antal mindre enheder benyttes (f.eks. 4 x 5.000 L i stedet for 1 x 20.000L), ses også.
Mammale celler og ekspressionssystemer til udtrykkelse af terapeutiske proteiner er beskrevet i Dansk Kemi nr. 9 [2]. I denne artikel beskrives nogle af udfordringerne i forbindelse med udviklingen af dyrkningsprocesser til produktion af terapeutiske proteiner i mammale celler.
Cellers egenskaber
Cellelinjerne, der benyttes som værtsceller til udtrykkelse af terapeutiske proteiner [2], er oprindelig isoleret fra væv, hvor de er omgivet af et næringsrigt filtrat af blod. Filtratet er på vej fra den semipermeable væg i de kapillære arterieårer (højt tryk) gennem vævet til veneårerne (lavt tryk) [3]. Næringsstoffer såsom ilt og sukker kommer med dette filtrat af blod til cellerne, og affaldsstoffer såsom CO2 og laktat føres bort. Dette giver desuden en stabil pH-værdi (7.4) omkring cellerne.
Det er disse forhold, man skal tage udgangspunkt i, hvis man skal dyrke mammale celler in vitro. Jo længere man bevæger sig væk fra de oprindelige in vivo forhold, jo mere er det nødvendigt at vide om den enkelte cellelinje, hvor den kommer fra, og hvilke specifikke krav den har. Målet er at udvikle en simpel proces, hvor overflødige næringsstoffer kan udelades og dermed undgå vanskeligheder i den senere oprensningsproces og/eller problemer med produktets renhed, opløselighed og stabilitet.
En række væsentlige egenskaber ved mammale celler er vist i tabel 1 og sammenlignet med bakteriers. Bioreaktorer, der benyttes til celledyrkning i produktionsskala (boks 1), er udformet, så de så vidt muligt tager hensyn til cellernes egenskaber og skaber et miljø, der giver samme vækst og produktdannelse som i laboratoriesystemer.
Den store cellestørrelse og manglen på en cellevæg gør mammale celler meget følsomme over for mekaniske påvirkninger. Samtidig skal det sikres, at der tilføres tilstrækkeligt med ilt til respiration, og at den kuldioxid, der produceres ved respirationen, fjernes. Derudover skal der være kort opblandingstid, så væske der tilsættes, og affaldsstoffer der produceres, fordeles homogent i hele væskerumfanget. Disse forhold er afgørende for valg af den måde gasser tilføres på og for valg af omrørertype og -hastighed.
De mammale cellers naturlige miljø er, som beskrevet ovenfor, væv, hvor de er pakket meget tæt sammen og signalerer indbyrdes. Signalstofferne er vigtige for cellevæksten, og som konsekvens heraf kan man ikke fortynde sin kultur under en vis kritisk grænse, uden at væksten går i stå. Det betyder, at hvor man i mikrobiel dyrkning kan overføre en kultur fra laboratoriet til en tank på nogle 1000 L, må mammale celler gennem en ekspansion bestående af en serie tanke, f.eks. 10 L, 100 L og 1000 L for at fremstille celler nok til at starte en produktionskultur på 10.000 L.
Den omstændighed, at fordoblingstiden for en mammal cellekultur er omkring et døgn mod en halv time for bakterier, gør processerne langvarige og stiller store krav til udstyret, der skal udgøre en barriere mod kontaminering med mikroorganismer fra omgivelserne. En mikroorganisme, der trænger ind, vil meget hurtigt kunne overvokse cellekulturen.
Mammale cellers næringskrav er meget komplekse ift. mikroorganismers. En bakteriekultur kan typisk dyrkes i et medium med omkring 15 forskellige komponenter, mens et mammalt cellemedium skal have 50–80 forskellige komponenter (tabel 2). Eksempelvis kan bakterierne selv syntetisere aminosyrer, mens de mammale celler som minimum skal have tilført de essentielle aminosyrer.
Den sidste egenskab, der er anført i tabel 1 – krav om vedhæftning til overflader – er en konsekvens af, at celler i væv vokser på andre celletyper og på hinanden. Begge de hyppigt anvendte cellelinjer BHK og CHO kan oftest adapteres til at vokse i suspension som enkeltceller eller løse aggregater af et begrænset antal celler. Er dette ikke muligt, må man bringe dem i kontakt med en egnet overflade, som de kan vokse på. I laboratoriet dyrker man cellerne på bunden af plastflasker, der placeres i inkubatorer med passende temperatur, CO2-koncentration og fugtighed i luften (typisk 37°C, 5 % CO2 og 80 % relativ fugtighed). I bioreaktorer kan der benyttes kugleformede partikler, såkaldte microcarriers, med en diameter på omkring 200 µm og en vægtfylde, som er lidt højere end mediets. Cellerne hæfter til kuglerne og vokser, så de danner et eller flere lag i og på kuglerne. Sådanne microcarrier-kulturer benyttes ved fremstilling af rFVIIa (rekombinant Faktor VIIa), det terapeutiske protein i blødermedikamentet, NovoSeven [4].
Mediumdesign
Et eksempel, på at medium til dyrkning af mammale celler designes mhp. at efterligne forholdene i væv, er det ofte anvendte HCO3-/CO2 pH-buffersystem, hvor man tilsætter 24 mM bikarbonat til mediet, som holdes i ligevægt med en atmosfære beriget med 5% CO2. Hvis en øget bufferkapacitet ønskes, hæves koncentrationerne til eksempelvis 48 mM og 10%. Dette buffersystem kan suppleres med eller erstattes af organiske buffere såsom 10-20 mM HEPES, hvilket ligeledes reducerer pH-stigningen, når kulturerne håndteres uden for inkubatorens CO2-berigede atmosfære.
Vand kan frit diffundere gennem en cellemembran, og da de mammale celler ikke har en cellevæg, vil de enten eksplodere eller implodere, hvis den osmotiske trykforskel mellem det intra- og ekstracellulære miljø bliver for høj. Dette forhold dikterer et anvendeligt koncentrationsområde (220-420 mOsm) for summen af opløste stoffer og sætter en begrænsning for, hvor meget vækst og produktion af terapeutisk protein et medium kan understøtte.
De medier, man klassisk har brugt til celledyrkning, har oveni de mange definerede komponenter været tilsat kalveserum, der indeholder vækstfremmende og afgiftende komponenter. En række af de terapeutiske proteiner, der er kommet på markedet for mellem 10 og 20 år siden, fremstilles på basis af medier med serum. Serum er supernatanten eller filtratet af størknet blod og er derfor uden hvide og røde blodlegemer og størkner ikke. Serum indeholder alle stoffer, som cellerne normalt er omgivet af i en mammal organisme plus proteiner større end 70 kDa, som normalt holdes tilbage af den semipermeable væg i de kapillære arterieårer [3]. Serum indeholder bl.a. albumin, som er et protein, der effektivt beskytter cellerne mod eksempelvis oxidation. Serum har derfor været anvendt siden man startede med at dyrke isolerede mammale celler for omkring 100 år siden.
Anvendelsen af serum er forbundet med en række ulemper. Det er dyrt, varierer i kvalitet, er kemisk udefineret og de mange proteiner i serum kan interferere ved oprensningen af det ønskede protein. Den største ulempe er dog risikoen for indhold af virus og prioner. Prioner kan eksempelvis forårsage en variant af Creutzfeldt-Jakobs sygdom ved overførsel fra køer med kogalskab (BSE). Da New Zealand endnu ikke har været ramt af kogalskab, må kalveserum derfra fortsat bruges til fremstilling af proteiner til terapeutisk anvendelse. Virus kan opformeres i mammale celler, mens prioner hidtil kun er observeret opformeret i væv i levende dyr og mennesker. I 2004 kom der en mere restriktiv vejledning for godkendelse af nye medicinske produkter fremstillet ved brug af animalske stoffer eller stoffer, der har været i kontakt med dyr [5]. Baggrunden var dels risikoen for overførsel af smitte til mennesker, og dels det faktum, at det på daværende tidspunkt havde vist sig teknisk muligt at eliminere serum og andre animalske råvarer fra dyrkningsmedier anvendt til fremstilling af terapeutiske proteiner. I sådanne medier skal serums positive egenskaber leveres af andre komponenter, og det er ofte svært at opnå samme robusthed og væksthastigheder som i serumholdige medier. Gordon Sato udviklede det første serumfri medium i 1976 til studie af celler i forholdsvis lav tæthed (ca. 1 mio. celler/ml) [6]. I dag findes medier, der er fri for animalske komponenter, proteinfri, kemisk definerede og som understøtter høje celletal (10 mio. celler/ml) samt produktion af protein i høje koncentrationer (op til 5 g/L).
De mange forskellige komponenter gør det til en fysisk-kemisk udfordring at designe og fremstille et medium m.h.p. at undgå redoxreaktioner og udfældninger. Medierne indeholder desuden en række komponenter, der er varmelabile. Det betyder, at man ikke kan varmesterilisere dem, men må benytte membranfiltrering, der er en mindre sikker metode.
Mammale cellers fysiologi er kompleks; de har en række signalsystemer, der registrerer sammensætningen af det omgivende medium. Alt efter hvilke stoffer og hvilke koncentrationer cellerne registrerer, reguleres deres vækst, deres proteindannelse og ultimativt deres død. Det sidste kaldes apoptose og er en programmeret celledød bestående af en kaskade af kontrollerede nedbrydningsprocesser, der sættes i gang af visse eksterne forhold. Apoptose står i modsætning til nekrose, som er celledød forårsaget af mere direkte årsager såsom toksin eller mekanisk påvirkning. Apoptose har visse fordele i vævet, men som regel ikke når celler skal dyrkes mhp. proteinproduktion. Hvis eksempelvis koncentrationen af blot en enkelt aminosyre falder til et lavt niveau, kan cellerne sætte apoptosen i gang. Konsekvensen kan også være en ændret posttranslatorisk processering af det udtrykte terapeutiske protein. Vi er endnu ved at lære disse signalsystemer at kende, og der venter et meget spændende arbejde med at afdække dem.
Procestyper
Mammale celler kan dyrkes i en række forskellige processer (boks 2). Figur 2 viser koncentrationerne af nogle vigtige metabolitter samt udviklingen i antal levende celler pr. ml og produktkoncentration mod tiden i en simpel batchkultur af CHO-K1-celler. Batch- og fed-batchkulturer er simple og robuste processer, som ofte bruges, når proteinet er rimelig stabilt i mediet. Ved de kontinuerte og semikontinuerte processer spares tid og ressourcer til fremstilling af podekultur og til opbygning af biomasse i produktionsenheden. Der kan derfor produceres mange tankvolumener produkt fra de samme celler på kortere tid. Microcarrier-kulturer benyttes, dels når udbyttet pr. celle er lavt, dels når proteinet er ustabilt ved cellekulturbetingelser, og således hurtigst muligt skal stabiliseres ved f.eks. nedkøling eller pH-justering.
Optimeringsmuligheder
Akkumuleringen af et terapeutisk protein i en cellekultur kan i de simpleste tilfælde udtrykkes som produktet af den cellespecifikke produktivitet (qp) og det samlede antal levende celletimer eller arealet under vækstkurven, svarende til det første led i ligningen i figur 3. For vanskelige, labile proteiner vil der under processen ske nedbrydning og polymerdannelse (aggregering). Produktivitet per celle, qp ligger typisk mellem 0,5-50 pg/celle/dag. Det antages ofte, at den er konstant når produktionscellelinjen er valgt. Derimod kan man via procesoptimering øge arealet under vækstkurven ved at stimulere væksten gennem mediumdesign og tilsætning af næringskoncentrater (for fed-batchprocesser) samt ved justering af sætpunkter for pH, temperatur, pO2, pCO2 og derved opnå betydelige stigninger i proteinudbyttet. Det er ikke altid korrekt, at qp er konstant og upåvirkelig. Ofte ser man, at qp aftager med voksende celletæthed, og i nogle tilfælde kan der også være effekt af f.eks. temperatur og pH. Det er dog vanskeligt at afgøre, om det er produktionshastigheden eller nedbrydning/aggregering, der ændrer sig, da man ofte kun kan måle nettoresultatet.
Figur 4 viser en cyklus, som kan anvendes til at optimere en proces til produktion af et terapeutisk protein mht. proteinkvalitet og udbytte. I praksis kan cyklussen gentages på flere stadier i udviklingen af en proces. I tabel 3 er vist nogle af de mange analyser, der anvendes. Det er vigtigt, at analyserne foretages på forskellige tidspunkter i løbet af dyrkningen for at kunne bestemme forbrugshastigheden af en komponent og dermed beregne, hvor meget der skal tilsættes, for at den ikke slipper op og måske inducerer apoptose.
Under optimering er det afgørende, at man ikke alene fokuserer på proteinmængden, men også undersøger, om der sker ændringer i kvaliteten af proteinet. Hvis et højt udbytte opnås på bekostning af proteinkvalitet, kan resultatet samlet set være en reduktion i udbyttet af oprenset protein. De posttranslatoriske modifikationer, som er nævnt i [2] er ofte påvirket af cellefysiologien og bestemmende for nogle af de afgørende proteinkvalitetsparametre. Pilotforsøg har vist, at proteinudbyttet ved fremstilling af FVIIa kan øges betydeligt ved den rette kombination af fysiologiske betingelser. Ulempen er imidlertid, at en del af de N-bundne glykanstrukturer mangler en endestillet sialsyre. Den manglede sialsyre bevirker, at proteinet fjernes hurtigt fra blodbanen og derfor ikke medvirker ved koagulation af blodet [7,8]. I produktionsprocessen benyttes derfor betingelser, der giver lavere proteinudbytte, men den ønskede sialyleringsgrad.
Opskalering
Det er en udfordring at overføre celledyrkningsprocesser fra laboratoriet til den industrielle skala. Som nævnt influeres nogle af de processer, der bestemmer proteinernes egenskaber, af det fysisk-kemiske miljø omkring cellerne, og selv mindre ændringer kan have stor betydning.
En sikker vej ud af opskaleringsproblematikken er at multiplicere antallet af laboratoriedyrkningsflasker og automatisere processen. Derved kan man hurtigt etablere stor kapacitet uden at skulle forstå nye kritiske faktorer under opskalering og dermed komme på markedet før en konkurrent. Denne vej blev benyttet af det amerikanske, biofarmaceutiske firma, Amgen, som producerer EPO i et meget stort antal 200 mL Roller Bottles, der håndteres automatisk i et aseptisk miljø [9]. De fleste andre firmaer i branchen benytter dog bioreaktorer tilpasset dyrkning af mammale celler og har skaleret processerne op, ofte til flere 1000 liter via forsøg i tilsvarende systemer i laboratorie- og pilotskala.
De forhold, som er mest vanskelige at få ens i forskellige størrelser bioreaktorer, er gas/væske-overgangene og opblandingen. I celledyrkningsmedier benyttes som nævnt ofte HCO3-/CO2 som det dominerende pH-buffersystem. Desuden er processerne iltforbrugende (figur 5). I startfasen, hvor der er få celler holdes pH nede i det ønskede område ved at tilføre CO2-gas, og da iltforbruget er begrænset tilføres atmosfærisk luft. Efterhånden som celletætheden øges, stiger syredannelsen, og der skal ikke længere tilføres, men fjernes CO2. Samtidig vokser iltforbruget, og der tilføres ofte ren O2-gas for at sikre aerobe forhold med et begrænset gasflow. I mikrobielle bioreaktorer benyttes omrørersystemer til at dispergere gassen effektivt i væsken. Den type omrører, der er optimal til mikroorganismer, er uegnet i mammale bioreaktorer, da den lokalt afsætter for stor energi og dermed stresser cellerne mekanisk. I stedet benyttes gasfordelere, der genererer små bobler og omrørertyper, som giver god opblanding ved lav og relativt ensartet energiafsætning i hele væskevolumenet. Figur 6 viser bobler fra en klassisk gasfordeler, en såkaldt ringsparger, til mikrobielle bioreaktorer og bobler fra en mikrosparger, der benyttes i mammale bioreaktorer. Ringspargeren er et rør med huller placeret i en ring. Mikrospargeren er lavet af sintret rustfrit stål. I figur 7 er vist en hyppigt benyttet omrørertype til mammal celledyrkning. Den har typisk en diameter, som er halvdelen af tankdiameteren.
Opsummering
Mammal celledyrkning i produktionsskala er en etableret teknologi i den biofarmaceutiske industri. Gennem de 20–25 år, hvor der er arbejdet med udvikling og produktion af terapeutiske proteiner, har værtsceller, dyrkningsmedier og såvel procedurer som hardware gennemgået »learning loops«, og der er fundet anvendelige og mere eller mindre standardiserede løsninger på de dilemmaer, man står over for ved procesudvikling. Arbejdsfeltet er dog præget af konservatisme, da selv små ændringer i processerne kan have konsekvenser for produktkvaliteten. Pga. den mere komplekse fysiologi (eks. apoptose) har en kultur med mammale celler ikke så vide parametergrænser som en bakterie- eller gærkultur. Der er formentlig et væsentligt potentiale for forbedringer, som kan forventes udnyttet, når de biofarmaceutiske firmaer på et tidspunkt overgår til i højere grad at fokusere på procesinnovation end tilfældet er nu, hvor produktinnovation og hastighed i produktudviklingen er de afgørende succesfaktorer. En øget akademisk og uddannelsesmæssig indsats med fokus på mammal cellefysiologi er derfor væsentlig for at dette potentiale kan realiseres.
Referencer
1. ACTIP – Animal Cell Technology Industrial Platform. http://www.actip.org/manuals/libraryfiles/animalcelltech.html.
2. Produktion af terapeutiske proteiner i mammale celler – 1, Dansk Kemi nr. 9, 2007.
3. Schmidt-Nielsen K. (1961) Animal Physiology, 3rd ed. Foundation of Modern Biology series, Mcelroy WM and Swanson CP (eds.). Prentice-Hall, New Jersey.
4. Julander, B et. al. (2001) Recombinant Activated Factor VII (rFVIIa): Characterization, Manufacturing and Clinical Development, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27(4), 373 – 383.
5. European Medicines Agency, EMEA (2004) Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via human and veterinary medicinal products (EMEA/410/01 Rev. 2 – October 2003) adopted by the Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP) and by the Committee for Veterinary Medicinal products (CVMP). Official Journal of the European Communities C 24, 28.1.2004 p. 6-19.
6. Hayashi I. and Sato G. (1976) Replacement of serum by hormones permits growth of cells in a defined medium. Nature 259, 132 – 134.
7. Rexen P., Klausen N.K. and Petersen J.M. (2003) Changes to NovoSeven Fermentation: Effects on Glycosylation – A Case Study. Paper presented at WCBP 2003: 7th Symposium on the Interface of Regulatory and Analytical Sciences for Biotechnology Health Products, January 7 – 10, San Francisco, CA.
8. Klausen NK, Bayne S, Palm L. (1996) Analysis of site-specific asparagine-linked glycosylation of recombinant factor FVIIa by glycosidase digestion, liquid chromatography, and mass spectrometry. Molecular Biotechnology 9, 195 – 204.
9. Butler M. (2004) Animal cell culture and Technology. Bios Scientific Publishers, London.
Boks 1
Produktionsudstyr anvendt til mammale celler
Roller Bottles: Det klassiske system til dyrkning af vedhæftningsceller i større skala. Flaskerne har eksempelvis en overflade på 850 cm2 og et medierumfang på 200 ml. De beluftes med luft/CO2-blanding og placeres på et rullestativ i et varmeskab. De roterer med 0,5 – 2 rpm under inkuberingen. Ved automatisering af håndteringerne (podning og medieskift) kan der etableres stor kapacitet.
Hollow Fiber bioreaktorer: Cellerne dyrkes i det rum, der er mellem fibrene i en Hollow Fiber-filterenhed. Der pumpes medium gennem fibrene og næringsstoffer transporteres over membranen til cellerne, mens affaldsstoffer transporteres den modsatte vej. Der benyttes membraner med molvægts-cut off omkring 10.000 Da. Produktakkumuleringen sker derfor på den side af membranen, hvor cellerne vokser. Der høstes løbende produkt, og der fjernes celler efter behov. En filterenhed (0.5 L) svarer i celletal til en 10 L dyrkningstank. De apparater, der er på markedet opererer med op til seks parallelle filterenheder. Systemet benyttes til celler, der ikke hæfter til overflader, typisk hybridomaceller og til proteiner til non-kliniske anvendelser, typisk assay-antistoffer.
Wavebags: Engangsbioreaktor, der består af en plasticpose, forsynet med pH-, pO2- og temperatursensorer samt gas/væske-til- og afgange. Hele systemet leveres strålesteriliseret. Posen placeres på et vippebord. Bordpladen er dækket af et elektrisk varmetæppe, der sikrer den ønskede dyrkningstemperatur. Opblanding sker ved at posen vippes fra side til side på bordet. Gasser kan tilføres over eller under væskeoverfladen til regulering af pH og pO2. Poserne kan fås i størrelser fra 100 mL til 500 L. De leveres i en version med et væskefilter, således at de kan benyttes til perfusionskultur.
Bioreaktorer med omrørere: Tanke med et højde/diameterforhold på 1:1 eller 2:1, forsynet med en omrører (figur 7), tilførsel af ren damp og rene gasser (luft, CO2, O2 og evt. N2) og væsker samt en kappe til temperaturregulering. Ståloverflader skal være poleret fint og passiveret, og materialer i produktkontakt må ikke lække cytotoksiske stoffer. Disse tanke er de oftest anvendte.
Airlift bioreaktorer: Variant af sidstnævnte. Disse tanke er uden omrører. I stedet benyttes gas-gennembobling til at sikre opblanding. Højde/diameter-forholdet er op til 10:1, og der kan benyttes et lederør til at dirigere væskestrømningen i tanken.
Tankstørrelser af bioreaktorer med omrørere og airlift bioreaktorer:
• Laboratorieskala: 1 – 10 L
• Pilotskala: 10 – 2.500 L
• Produktionsskala: 500 – 25.000 L
Boks 2
Procestyper anvendt til mammale celler
Batchkultur (A i figur 1.1 og 1.2): Den simpleste procestype, en batchkultur, består i at pode cellerne i den ønskede celletæthed og lade cellerne vokse til maksimal tæthed, hvorefter de begynder at dø på grund af næringsmangel eller for høj koncentration af toksiske metabolitter. Temperatur og pH styres, og kulturen holdes opblandet vha. omrøring. Processen standses, når andelen af levende celler er nået under en forudbestemt grænse. Cellerne fjernes ved centrifugering og/eller filtrering, og fra den klare cellefri væske kan det terapeutiske protein oprenses ved en serie af kromatografiske trin.
Repeated batch (B i figur 1.1 og 1.2): Denne proces forløber som batchprocessen; blot med den ændring at når den maksimale celletæthed nås, tages en del af kulturen ud og erstattes med frisk medium, således at celletætheden bliver som ved starten af processen. Processen kan derefter gentages. Ved denne metode sparer man fremstilling af podekulturer samt klargøring, rengøring og sterilisering af udstyret. Batch- og repeated batchprocesserne benyttes, når produktdannelsen sker samtidig med cellernes vækst.
Fed batch (C i figur 1.1 og 1.2): Denne proces forudsætter, at man ved, hvilke komponenter i mediet der er begrænsende. Når kulturen nærmer sig den maksimale celletæthed, der kan opnås i batchkultur, tilsættes den eller de begrænsende komponenter i koncentreret form. Derved opnås højere celletæthed, forlænget procestid med høj viabilitet og dermed højere udbytte af det terapeutiske protein ved processens afslutning. Fed batchprocesser benyttes til proteiner, der ikke kun udtrykkes i cellernes vækstfase, men så længe, der er levende celler tilstede. Proteinet skal desuden være stabilt ved cellekulturbetingelserne (pH 6,7–7,4, 35–37°C og fysiologisk osmotisk tryk). Et typisk eksempel på protein som produceres effektivt i fed batchprocesser er monoklonale antistoffer.
Perfusionskultur (D i figur 1.1 og 1.2): Dette er en kontinuert proces, hvor cellerne tilbageholdes i tanken eller føres retur fra en ekstern enhed, der anvendes til separation af celler og væske.
Microcarrier-kultur (E i figur 1.1 og 1.2): Dette er en variant af perfusionskultur, hvor cellerne holdes tilbage i tanken vha. microcarriers, som de er bundet til. Microcarrierne bundfælder hurtigt, når omrøringen standses, og det ovenstående medium kan udskiftes med frisk medium. Der sker et tab af celler ved udskiftningen af mediet, fordi der altid vil være en andel af cellerne i fri suspension.
Figur 1.1. Vækstkurver for forskellige procestyper.
Figur 1.2 Diagrammer af procestyperne vist i figur 1.1.
Tabel 1. Sammenligning af mammale cellers og mikroorganismers egenskaber.
Tabel 2. Typisk indhold af E.coli-medium og mammalt cellemedium.
Tabel 3. Analyser foretaget på celler, medium og produkt.
Figur 2. Metabolit- og produktkoncentrationer samt celletal som funktion af tiden i en batchkultur af en rekombinant CHO-K1-cellelinje. Produktkoncentrationen er vist i arbitrære enheder.
Figur 3. Optimeringsmuligheder. P: Akkumuleret produktmængde, qp: Specifik produktivitet (produktmængde pr. celle pr. dag), N: Antal levende celler til tiden t, t: Tid, D: Akkumuleret mængde af nedbrudt produkt, A: Akkumuleret mængde af aggregeret produkt.
Figur 4. Cyklus under optimering af medium og proces til produktion af terapeutisk protein vha. mammale celler. Analyser foretaget på celler, medium og produkt er vist i tabel 3.
Figur 5. Gas/væske-overgange i celledyrkningstank.
Figur 6. Bobler fra ringsparger (til venstre, rør 6 mm diameter) og mikrosparger (til højre, 10 mm diameter).
Figur 7. Hyppigt benyttet omrørertype til celledyrkning.
