Forskergrupperne for biouorganisk og analytisk kemi, DTU har arbejdet med at undersøge den biologiske funktion ned på det enkelte molekyles niveau. Arbejdet er udført vha. de nyeste scanning probe mikroskopiteknikker og har givet spændende resultater.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Jingdong Zhang1, Esben P. Friis2, Niels H. Andersen1, Allan G. Hansen1, Jens U. Nielsen1, Hainer Wackerbarth1, Hans E.M. Christensen1, Bee Lean Ooi1, Jens E.T. Andersen1 og Jens Ulstrup1, 1Kemisk Institut, DTU
Direkte iagttagelse af biologiske enkeltmolekyler i deres naturlige biologiske miljøer er et af kemiens ultimative mål. Et andet er at kunne styre den biologiske funktion helt ned på det enkelte molekyles niveau.
Det har forskergrupperne i biouorganisk og analytisk kemi på Kemisk Institut, DTU arbejdet med de sidste syv år [1]. Forskningen er baseret på de nye scanning probe mikroskopier (SPM), scanning tunnel (STM) og atomic force mikroskopi (AFM) i den specielle in situ teknologi, hvor enkeltmolekyler og –biomolekyler, direkte i deres naturlige vandige reaktionsmedier, kan studeres. Det er suppleret med bred forskning inden for biouorganisk kemi og ny fysisk-orienteret elektrokemi. Der har været meget fokus på kobberproteinet azurin. Figur 1A viser dette molekyles tredimensionale struktur og figur 1B et in situ STM-billede af azurin i aktion som biologisk elektrontransportør på en atomart plan guldoverflade i molekylets naturlige vandige reaktionsmedium [2].
Tværvidenskabelige indgangsvinkler til biologisk enkeltmolekylkemi
Den biouorganiske kemi
Billeder som figur 1B er resultat af tværfaglig videnskab med flere udgangspunkter.
Metaller som jern, kobber, zink, molybdæn m.fl. indgår for det første i mere end en tredjedel af alle kendte proteiners funktion [3,4]. Der er altid involveret metalioner, når naturen udøver en sofistikeret funktion, f.eks. i fotosyntese, respiration, enzymfunktion og alle faser af DNA’s biologiske virksomhed. Den tværfaglige videnskab biouorganisk kemi dækker netop metallers kemi i biologiske systemer.
På DTU varetages biouorganisk kemi på Kemisk Institut, hvor mangeartet uorganisk, biokemisk, fysisk kemisk og genteknologisk teknik omkring metalloproteiner er bygget op. Som navnet siger hører azurin (figur 1) til klassen af blå kobberproteiner og er en meget attraktiv repræsentant for den biouorganiske kemi. Azurin er molekylær aktør i bakteriel respiration. Molekylet varetager elektrontransport, hvorunder kobberionen varierer mellem oxideret, Cu(II), og reduceret, Cu(I) tilstand. Kobber er koordineret til ligander fra proteinsystemet, og beskrivelse af den molekylære struktur og funktion hos metalloproteiner som azurin tager udgangspunkt i den uorganiske koordinationskemi. Det illustrerer det spændende samspil mellem den uorganiske kemi og proteinmolekylets biologiske del, der netop er den biouorganiske kemis indhold.
Scanning probe og scanning tunnel mikroskopi i vandige reaktionsmedier
Det andet udgangspunkt for enkeltmolekyl-bioteknologi er ny SPM-teknologi. Her fokuseres på STM, da denne mikroskopi både er rettet mod molekylernes ydre form og mod enkeltmolekylær elektronisk funktion. Figur 2A viser princippet i STM. Et molekyle er immobiliseret, dvs. fastgjort kemisk eller ved fysisk adsorption, på en atomart plan elektrisk ledende overflade, her en enkeltkrystal-guldoverflade, også kaldet substratet. En tynd metalnål, tippen, bringes ned til nogle Ångströms eller et par nanometers afstand fra substratet. Påtrykning af en spændingsforskel mellem tip og substrat (biasspændingen) får en elektrisk strøm (strøm af elektroner) til at løbe mellem substrat og tip. Strømmen er forårsaget af den kvantemekaniske tunneleffekt, der også er basis for tunneldioder, partikeludsendelse fra tunge atomkerner og andre grundvidenskabelige og teknologisk betydningsfulde fænomener. Tunnelstrømmen aftager hurtigt (eksponentielt) med afstanden mellem substrat og tip og bæres derfor af tippens yderste atomer. Strømmen er desuden meget følsom over for det mellemliggende materiales egenskaber. Når tippen bevæges hen over overfladen (overfladen scannes), kan den metalliske overflades og adsorberede molekylers egenskaber kortlægges med molekylær og undertiden atomar præcision. Tippens højde justeres normalt, så den målte strøm er konstant. Derved opnås et »topografisk kort«, der afspejler det mellemliggende rums, herunder adsorberede molekylers, egenskaber.
I langt de fleste tilfælde har STM været anvendt under ultrahøj vakuum eller gasformige (almindelig »luft«), ex situ betingelser. Høj (dvs. atomar) opløsningsevne er ofte fundet for små molekyler. Biologiske makromolekyler udøver deres funktion i vandige medier. Ex situ STM er derfor ikke umiddelbart repræsentativ for biologiske makromolekyler, men STM kan også bringes i anvendelse til kortlægning af molekylers og makromolekylers struktur og funktion i vandige buffermedier. Her er ny STM-teknologi påkrævet. Figur 2B viser princippet i in situ (vandigt buffermedium) STM. I ex situ STM er alene biasspændingen afgørende. Når substrat og tip er i kontakt med vandig opløsning (in situ STM), er særskilt kontrol af substratets og tippens elektrokemiske potential over for en fælles referenceelektrode absolut nødvendig. Tunnelstrømmene er nede i picoampere-området (10-12 A), og uønskede elektrokemiske processer ville helt dominere, hvis der blot påtryktes en spændingsforskel mellem tip og substrat. Tippen skal desuden dækkes af et isolerende lag, der alene udsætter dens yderste ende (i princippet de yderste atomer) for det vandige mediums indflydelse. Denne del bærer tunnelstrømmen, hvorimod den uønskede elektrokemiske strøm bæres af hele den eksponerede tipoverflade. Ved at tildække (»coate«) tippen undertrykkes de elektrokemiske strømme næsten fuldstændigt, og alene tunnelstrømmen bliver tilbage. I relation til biologiske makromolekyler er in situ STM som nyskabelse udviklet på Kemisk Institut, DTU.
Elektrokemi og atomart plane elektrodeoverflader
In situ STM er central i enkeltmolekylers kortlægning, men kan ikke stå alene og må støttes af anden teknologi. Da in situ STM fundamentalt set involverer elektronoverførsel mellem metalliske overflader og molekyler, er elektrokemi en af de vigtigste komplementære indgangsvinkler. Det elektrokemiske system må svare så nøje som muligt til in situ STM, og elektrodeoverfladerne skal være plane på det atomare niveau, dvs. veldefinerede metalliske enkeltkrystalplaner (figur 3). Ud over at svare til in situ STM-betingelserne giver enkeltkrystal-elektrokemi flere detaljer og mindre baggrundsstrøm i strøm-spændingsrelationerne, der også kan optages samtidigt med STM. Herved fås en direkte sammenhæng mellem detaljerne i det elektrokemiske voltammogram og det scenario, der udspilles i STM-billederne.
In situ STM som in situ enkeltmolekylspektroskopi
In situ STM rummer andre perspektiver. Den individuelle kontrol af substratets og tippens elektrokemiske potentialer medfører, at teknikken frembyder to typer strøm-spændingsrelationer [1,5]. Den ene er mellem tunnelstrømmen og biasspændingen lige som i STM i vakuum eller luft, med den forskel, at biasspændingens variation nu sker under fastholdelse af substratets elektrokemiske potential. Den anden relation er mellem tunnelstrømmen og substratets elektrokemiske potential – lige som i elektrokemi – men ved fastholdt biasspænding, hvor substratets og tippens elektrokemiske potentialer varieres parallelt. Herved ændres substratets elektrokemiske potential, samtidig med at enkeltmolekyler direkte under deres deltagelse i elektrokemiske processer »iagttages« med tippen.
Relationen mellem tunnelstrømmen og substratets elektrokemiske potential kan også anskues som en ny enkeltmolekylspektroskopi, hvor biasspændingen fungerer analogt med en monokromatisk lysstråle i optisk spektroskopi. Herved fremkommer enkeltmolekyle in situ tunnelspektre eller strømspændings »absorptionsbånd«, der afspejler vigtige fysiske egenskaber hos de adsorberede molekyler, lige som i optisk spektroskopi (figur 4 [5,6]).
Kemiske og biologiske systemer kortlagt med in situ STM og enkeltkrystal-elektrokemi
Figur 3A viser in situ STM af den specielle Au(111) krystalplan i kontakt med vandig buffer under fuld elektrokemisk kontrol. Atomart plane områder (terrasser) af flere hundrede nanometers udstrækning adskilt af monoatomare trin ses tydeligt. Billedet til højre er »zoomet ind« og viser overfladens enkelte atomer direkte i den vandige opløsning.
Azurin er et velkarakteriseret, redoxaktivt metalloprotein, der er velegnet som fokusmolekyle i ny nanoskalakemi og bioteknologi. Azurin udviser et andet træk, der gør det til et godt valg. En af de vigtigste forudsætninger for karakterisering af enkeltmolekyler med in situ STM er, at molekylerne kan fikseres eller »immobiliseres« i veldefinerede orienteringer på metaloverfladen. En disulfidbro i azurins overflade (figur 1A) bevirker netop, at molekylet kan fastgøres på Au(111) ved kemisorption, dvs. næsten kovalent bindingsdannelse mellem svovlatomerne og guldatomer på substratoverfladen. Immobiliseringen er så nænsom, at azurin bevarer sin integritet som molekylær elektrontransportør. Figur 1C viser et differentielt pulsvoltammogram (en følsom elektrokemisk strøm-spændingsrelation) af et azurinmonolag på Au(111). Et signal omkring 100 mV vidner om, at kobberionen har bevaret sin evne til at udveksle elektroner med elektrodeoverfladen [1,2]. Immobiliseret azurin er altså fuldt funktionsdygtigt, og in situ STM som på figur 1B viser azurin-enkeltmolekyler direkte i elektrontransporterende aktion.
Svovlatomers velegnethed som molekylær forbindelsesgruppe (molekylært »anker« eller »link«) er også vist på figur 5, der viser et monolag af den svovlholdige aminosyre cystein adsorberet på Au(111) i vandig buffer [7]. Et velorganiseret hydrogenbundet og elektrostatisk netværk af cysteinmolekyler udstrækker sig over store domæner. Hver klynge indeholder seks cysteinmolekyler, hvor svovlatomerne fremtræder med stærke kontraster. Også nitrogen- og carbonatomer, men ikke oxygenatomer giver STM-kontrast. Billedet viser den næsten atomare in situ STM-opløsningsevne, også i vandig elektrolytopløsning. Det viser også, at STM ikke direkte afbilder molekylernes topografiske form, men deres elektriske ledningsevne og de enkelte atomers eller molekylfragmenters evne til at transmittere elektroner. Figur 5 til højre illustrerer cysteinmonolagets høje laterale orden på anden vis. Adsorption af thiolgrupper ledsages af oxidation af Au-S-overfladelaget. Au-S-laget kan reduceres elektrokemisk under frigørelse af thiolen i en reduktiv desorptionsproces. Det meget skarpe voltammetriske signal vidner om høj strukturel orden i cysteinlaget. Mindre orden som på polykrystallinsk guld giver et langt bredere signal.
Figur 6B viser in situ STM af et hæmoprotein, cytochrom c fra en gærart (figur 6A). Cytochrom c er også et elektrontransportprotein, hvis centrale funktionsdel er en hæmgruppe med jern som indgående metal. Proteinet indeholder en fri thiolgruppe (-SH), der kan være »link« mellem proteinet og guldoverfladen, men da gruppen sidder lidt »inde i« proteinstrukturen, medfører binding til guldoverfladen nogen deformation af proteinstrukturen. Au-S-binding finder faktisk sted, men bindingen er ikke så stærk som for azurin, og der dannes kun ca. 15% af et monolag. En interessant udnyttelse er vist på figur 6C, hvor STM-tippen i et veldefineret rektangulært område er benyttet til at skrabe overfladen ren. Det kunne rumme nogle interessante perspektiver for konstruktion af nanoskala-proteinarrays i veldefinerede geometriske udformninger. Figur 7B viser in situ STM af et kort syntetisk oligonukleotid (DNA-fragment) med fem basepar (adenin og thymin, 5-A-T, figur 7A) og en påhæftet thiol-linker. I homogen opløsning er den korte dobbelthelix »smeltet«, dvs. den optræder som enkeltstrenge. På Au(111)-overfladen dannes kun veldefinerede in situ STM-kontraster, når begge strenge er tilstede. Det tyder på, at dobbeltstrengen stabiliseres på den metalliske overflade. Det kan få betydning for forståelse af oligonukleotiders og DNA’s elektroniske ledningsevne, for tiden et meget aktivt forskningsområde. Det kan også føre til direkte billeddannelse (visualisering) på enkeltmolekylniveau af oligonukleotiders »hybridisering«, dvs. enkeltstrenges binding til deres komplementære strenge. Det vil videre have betydning for visualisering af enkeltmolekylscreening af biologiske væsker med en mangfoldighed af medicinske og farmakologiske perspektiver til følge.
Nogle konkluderende iagttagelser
Biologiske molekyler og makromolekylers in situ STM i vandige buffermedier, i kombination med »state-of-the-art« elektrokemi og den brede tværfaglige videnskab biouorganisk kemi, er ved at åbne en ny verden inden for kemi og bioteknologi i nanometer- og enkeltmolekylskala. Som noget særligt i DTU’s nanoteknologiske og bioteknologiske programmer indgår metalioners mangeartede biologiske facetter i denne enkeltmolekyl-tværvidenskab på Kemisk Institut.
In situ STM er speciel ved ud over molekylers ydre form at afdække enkeltmolekylers og -biomolekylers elektroniske egenskaber. I relation til kemisk og biokemisk nanoteknologi er elektrokemisk in situ STM desuden unik ved både at sikre overfladens nøje kontrollerede tilstand og at indeholde en indbygget elektrisk kontakt til ydre elektriske kredsløb via elektrontransport tværs over den elektrokemiske fasegrænse mellem elektroder og adsorberede molekyler. Den flerfoldige teknologi anvendt på azurin og gær cytochrom c vil kunne bruges generelt på redoxproteiner. In situ STM og enkeltkrystal-elektrokemi har derved åbnet mulighed for også at følge elektrontransporterende enzymer i fotosyntese og respiration m.m. i det naturlige miljø og på et nyt nanoskalaniveau.
In situ STM og nanoskalaelektrokemi har andre teknologiske dimensioner. Billederne af cystein (figur 5) viser, at en metallisk overflade kan behandles og gøres hydrofob eller hydrofil afhængig af de adsorberede molekylers funktionelle grupper, under bibeholdelse af den strukturelle orden. Det vil kunne anvendes til at bringe proteiner og enzymer til adsorption i forskellige, men veldefinerede orienteringer [1]. Efterfølgende in situ STM frembyder enestående indgangsvinkler til molekylære biosensorer, hvor biologiske substrater for immobiliserede enzymer vil kunne påvises på enkeltmolekylniveau. DNA-fragmenters in situ STM er et andet eksempel, hvor biologiske væsker vil kunne screenes på enkeltmolekylniveau. Biomolekylers in situ STM vil endelig kunne kombineres med anden, fysisk in situ nanoteknologi. In situ STM kan f.eks. være et effektivt værktøj til nøje kontrolleret frembringelse af nanoskala-»huller«, »udfræsninger« m.m. i metalliske overflader under ganske milde betingelser. Et eksempel er vist på figur 8 [8], jfr. figur 6. Redoxenzymer (»enkeltmolekylære biosensorer«) vil kunne fikseres i sådanne metalliske nanostrukturer i multifunktionelle molekylære enzymarrays med nye enkeltmolekyle elektroniske egenskaber [9]. Kemisk Institut er engageret i et større EU-projekt med sådanne mål for øje.
Undervisnings- og forskeruddannelsesprogram
Forskningsprogrammer inden for biouorganisk kemi og nanoskalabioteknologi på Kemisk Institut, DTU er, sluttelig, afspejlet i et spændende undervisnings- og forskeruddannelsesprogram. Det omfatter en kursuspakke: Koordinationskemi (26124), Biouorganisk kemi (26126) og Eksperimentalkursus i koordinationskemi og biouorganisk kemi (26122); et årligt udbudt ph.d.-kursus i teoretiske grundlag for molekylær elektrontransport, nanoskalakemi, STM og elektrokemi (26900) samt polytekniske midtvejs-eksamens- og ph.d.-projekter inden for bl.a.: metalloproteiners elektroniske egenskaber og foldningsmekanismer; metalloproteiners elektrontunnel-effekter og elektrostatiske egenskaber, metalloproteiners og organiske molekylers in situ STM og SPM, metalloproteiners og DNA-fragmenters elektrokemi på atomart plane elektrodeoverflader; flerkernede metalkomplekser i koordinationskemi og biouorganisk kemi samt genteknologisk fremstilling af metalloproteiner og rekombinante metalloproteiners fysisk-kemiske egenskaber.
Referencer
1. J. Zhang, Q. Chi, A.M. Kuznetsov, A.G. Hansen, H. Wackerbarth, H.E.M. Christensen, J.E.T. Andersen, J. Ulstrup: Electronic properties of functional biomolecules at metal/aqueous solution interfaces. J. Phys. Chem. B 106: 1131-1152 (2002). Feature article.
2. Q. Chi, J. Zhang, J.U. Nielsen, E.P. Friis, I. Chorkendorff, G.W. Canters, J.E.T. Andersen, J. Ulstrup: Molecular monolayers and interfacial electron transfer of Pseudomonas aeruginosa azurin on Au(111). J. Am. Chem. Soc. 122: 4047-4055 (2000).
3. I. Bertini, H.B. Gray, S.J. Lippard, J.S. Valentine (Eds.): Bioinorganic chemistry. University Science Books, Mill Valley (1994).
4. A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, K. Wieghardt (Eds.): Handbook of metalloproteins. Wiley, Chichester (2001).
5. A.M. Kuznetsov, J. Ulstrup: Mechanisms of in situ scanning tunnelling microscopy of organized redox molecular assemblies. J. Phys. Chem. A 104: 11531-11540 (2000).
6. N. Tao: Probing potential-tuned resonant tunneling through redox molecules with scanning tunneling microscopy. Phys. Rev. Lett. 76: 4066-4069 (1996).
7. J. Zhang, Q. Chi, J.U. Nielsen, E.P. Friis, J.E.T. Andersen, J. Ulstrup: Two-dimensional cysteine and cystine cluster networks on Au(111) disclosed by voltammetry and in situ scanning tunneling microscopy. Langmuir 16: 7229-7237 (2000).
8. Q. Chi, J. Zhang, E.P. Friis, J.E.T. Andersen, J. Ulstrup: Creating nanoscale pits on solid surfaces in aqueous environment with scanning tunnelling microscopy. Surf. Sci. Lett. 463: L641-648. A method for fabricating nanoscale patterns on a surface: US Pat.09/497.881.
9. A.M. Kuznetsov, J. Ulstrup: Mechanisms of molecular electronic rectification through electronic levels with strong vibrational coupling. J. Chem. Phys. 116: 2149-2165 (2002).
Figur 1.
A: Tredimensional struktur af azurin fra bakterien Pseudomonas aeruginosa. Cu-ionen og disulfidbroen er fremhævet.
B: In situ STM-billede af azurin på Au(111) i vandig buffer (ammoniumacetat, pH 4.7) under fuld potentialkontrol [1,2]. De enkelte strukturer viser elektrontransporterende azurinmolekyler.
C: Differentielt pulsvoltammogram. Signalet ved 100 mV afspejler immobiliseret azurins elektrokemiske aktivitet.
Figur 2. Ex situ (A) og in situ (B) STM. I ex situ STM kontrolleres tunnelstrømmen alene af biasspændingen mellem tip og substrat. I in situ STM er tip- og substratpotentialet kontrolleret over for en fælles referenceelektrode, og tippen er dækket af et isolerende materiale ud til de yderste atomer.
Figur 3.
A: In situ STM-billede af en enkeltkrystal Au(111)-overflade i fortyndet perchlorsyre under fuld elektrokemisk potentialkontrol.
B: samme overflade med atomar opløsning.
Figur 4.
A: In situ STM-tunnelstrøm eller »tunnelspektre« (her i form af den »tilsyneladende tipafstand«) for jernprotophorphyrin IX (Fepph) adsorberet på en atomart plan grafitelektrode, som funktion af elektrodens elektrokemiske potential i vandig boratbuffer. [6]. Fepph er den centrale funktionelle gruppe i hæmoglobin og myoglobin..
B: Teoretisk beregnede (»normaliserede«) tunnelspektre [5]. Der er maksimum i tunnelspektret tæt ved Fepph’s elektrokemiske ligevægtspotential.
Figur 5.
A: Højopløst in situ STM-billede af den svovlholdige aminosyre cystein adsorberet på atomart plant Au(111) i 50 mM ammoniumacetat buffer under fuld elektrokemisk potentialkontrol. Hver klynge indeholder seks cysteinmolekyler [7]. De skarpe diagonalt orienterede kontraster viser svovlatomer. Tallene angiver de underliggende guldatomers atomare orden. De øvrige kontraster kan tilordnes den molekylære model aftegnet med gråt. Tre hydrogenbundne cysteinmolekyler er orienteret parallelt og modsat tre andre, ligeledes parallelt orienterede molekyler. Enkelte sorte huller viser steder, hvor et cysteinmolekyle »mangler« i netværket. Billedet viser den høje præcision i små eller mellemstore adsorberede molekylers strukturelle organisation i deres naturlige medier, der kan opnås ved in situ STM.
B: Lineært voltammogram (strøm-spændingsrelation) for reduktiv desorption af cystein fra Au(111)-overfladen. Det skarpe signal vidner om høj strukturel orden i cysteinlaget og om meget velkontrollerede og »superrene« elektrokemiske betingelser.
Figur 6.
A: Tredimensional struktur af cytochrom c fra gærarten Saccharomyces cerevisiae. Hæmgruppen med jernatomet og thiol-gruppen nær proteinets overflade er fremhævet.
B: In situ STM-billede af gær cytochrom c på Au(111) i vandig buffer under fuld potentialkontrol. Som på figur 1 viser de enkelte strukturer elektrontransporterende molekyler. Cytochrom c er svagere adsorberet end azurin og monolagstætheden væsentligt mindre.
C: Rektangulært område, hvor den cytochrom c dækkede overflade er »skrabet ren«.
Figur 7.
A: Tredimensional struktur af det korte DNA-fragment 5-A-T (A = adenin, T = thymin). Thiollinkeren er ikke vist, men er påsat den nederste ende af molekylet.
B: In situ STM-billede af 5-A-T på Au(111) (kemisk fastgjort med en –SH gruppe) i vandig phosphatbuffer under elektrokemisk potentialkontrol. Hver af de lyse kontraster repræsenterer ét adsorberet 5-A-T-molekyle. Enkeltstrenge af 5-A eller 5-T giver ikke velopløste billeder.
Figur 8.
A: Nanoskala-»hul« i en Au(111)-overflade frembragt ved in situ STM under nænsom elektronisk kontakt mellem tip og substrat i fortyndet perchlorsyre ved lav biasspænding [8]. Hullets trekantede form følger Au(111)-overfladens atomare struktur. Den centrale fordybning er to atomlag dyb og nogle nanometer i udstrækning. Fordybningen er omgivet af et større (30-40 nm) område af et enkelt atomlags dybde. »Opgravede« Au-atomer kan ses omkring hullets rand.
B: Bogstaverne T U (Technical University) skrevet med nanoskala»huller«
