Her beskrives nucleobasers fotofysik i opløsning, og hvordan vi i Aarhus vha. lagerringseksperimenter på isolerede nucleotider forsøger at afdække deres spændende fysik og kemi.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 12, 2004 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Steen Brøndsted Nielsen, Institut for Fysik og Astronomi, Aarhus Universitet
Naturens valg af nucleobaser i DNA og RNA skyldes sandsynligvis ikke kun de særlige Watson-Crick basepar, der på smukkeste vis forklarer DNA-replikation, RNA-transskription og proteinsyntese, men også at nucleobaserne virker som effektive solskærme mod ultraviolet stråling. Men hvordan er nucleotidernes fysik og kemi?
Nucleotider er DNA- og RNA-byggesten og indeholder en nucleobase, et sukkermolekyle og en phosphatgruppe (figur 1). Et nucleotid uden phosphatgruppen benævnes et nucleosid. Nucleobasers og nucleosiders fotofysik er velundersøgt, både når de er i opløsning og isolerede i gasfase (for nucleobasers vedkommende), og er detaljeret beskrevet i en nylig Chemical Review artikel [1]. Gasfaseeksperimenter er med til at give en forståelse af molekylernes karakteristiske egenskaber og er dermed væsentlige for at afdække opløsningsmidlets rolle.
Nucleobaser absorberer ultraviolet (UV) lys, maksimalt ved 260 nm. Den elektroniske overgang angives S0 ® S1, hvor S0 er den elektroniske grundtilstand og S1 den første exciterede tilstand (S angiver singlettilstand, dvs. totalt spin er nul). Excitationen sker til en antibindende p* orbital. Fluorescenskvanteudbyttet er meget lille (<10-4), og det samme er sandsynligheden for krydsning til en lavereliggende triplettilstand, T1 (to uparrede elektroner med parallelle spin, dvs. totalt spin én). Det antyder, at S1-tilstandens levetid er kort mht. indre omdannelse til S0.
Nucleobaser er effektive solskærme
For fire år siden udførte Bern Kohler og hans gruppe på Ohio State University nogle opsigtsvækkende eksperimenter, som bestemte nucleosiders S1-levetid efter UV-fotoexcitation i vandig opløsning [2,3]. Denne information er vigtig, da elektronisk exciterede molekyler ofte er meget reaktive. DNA’s dobbelthelixstruktur bygger på, at adenin hydrogenbinder med thymin og guanin med cytosin (de såkaldte Watson-Crick basepar [4], figur 2). Det er katastrofalt at miste denne præference, fordi en nucleobase modificeres kemisk efter fotoexcitation. Det fører til fejl i den genetiske kode og dermed mutationer. I værste fald cancer.
Med tidsopløst femtosekundspektroskopi målte Kohlers gruppe, at S1 ® S0 foregik i løbet af nogle få hundrede femtosekunder. Dvs. den farlige elektroniske energi omsættes ultrahurtigt til varme (vibrationsenergi) i molekylerne. Hurtig omdannelse af elektronisk energi til varme forekommer ofte, når to potentielle energioverflader rører ved hinanden i et punkt i et tredimensionelt rum, hvor to af akserne er geometrikoordinater. Et sådant punkt benævnes et konisk krydsningspunkt [5] og er teoretisk beregnet for deexcitationen af cytosin-nucleobasen [6].
Endvidere fandt de, at de varme nucleosider nedkøles til stuetemperatur i vandig opløsning efter nogle få picosekunder. Denne tid er også usædvanlig kort og skyldes hydrogenbinding af omgivende vandmolekyler til nucleosidet, og dermed en god kobling mellem nucleosidets og vandmolekylernes egensvingninger. Slutresultatet af fotoexcitationen er således uskadelig varme i det store »vandbad«.
Populært sagt virker nucleobaserne som effektive solskærme. Det kan have spillet en afgørende rolle for livets opståen på jorden for mere end en milliard år siden, før det beskyttende ozonlag var til stede. Idet kun fotostabile molekyler overlevede den stærke UV-bestråling, kan vi tale om »survival of the fittest« på molekylært niveau.
Ubesvarede spørgsmål
Dette banebrydende arbejde efterlader imidlertid en række ubesvarede spørgsmål.
Dissocierer nogle af de bestrålede nucleosider, mens de er i S1, omend levetiden af S1 er kort? Det kan ske, hvis der er en reaktionsvej på den exciterede tilstandsoverflade med ingen eller kun lille aktiveringsenergi.
Da det er nucleobasen, som elektronisk exciteres, vil den indre omdannelsesproces føre til vibrationel excitationsenergi hovedsageligt i nucleobasen. Til at begynde med besidder få svingninger derfor excitationsenergien (ikke-statistisk fordeling), men i løbet af picosekunder fordeles energien statistisk på alle molekylets svingninger bestemt af deres vibrationsenergi (jf. Boltzmanns fordeling). Med andre ord kanaliseres noget af energien ud i sukker- og phosphatgruppen. På engelsk betegnes dette intramolecular vibrational redistribution (IVR). Men er dissociation før IVR mulig, dvs. mens det meste af vibrationsenergien er lokaliseret i nucleobasen?
Selv efter IVR konkurrerer dissociation med nedkøling?
Den sidste proces er en statistisk dissociationsproces, mens en hurtigere dissociation er ikke-statistisk. En statistisk dissociationsproces defineres således som en proces, der kan beskrives med et statistisk udtryk for hastighedskonstanten, f.eks. det velkendte Arrheniusudtryk. Ionen antages at være i den elektroniske grundtilstand, og dens mikrokanoniske temperatur er bestemt af energien før excitationen og af fotonenergien. Dvs. vores spørgsmål kan sammenfattes til: hvad er sandsynligheden for beskadigelse via ikke-statistiske eller statistiske dissociationsprocesser?
For at besvare dette er gasfaseeksperimenter nødvendige. Vi har behov for at finde hastighedskonstanter for processerne i de isolerede molekyler, og det er her lagerringseksperimenter kommer ind i billedet.
Den århusianske lagerring ELISA
I det følgende gives først en kort beskrivelse af lagerringen ELISA (ELectrostatic Ion Storage Ring in Aarhus), hvorefter nogle nylige data for fotodissociation af AMP-nucleotidioner præsenteres.
Instrumentet er vist skematisk på figur 3 og består af en ionkilde, et accelerationsområde, en magnet, en injektionsdel og endelig selve ringen [7,8]. I ringen, eller racerbanen, kan lagres såvel atomare som molekylære ioner.
Ioner i opløsning bringes på gasform med electrospray ionisering. De dannede ioner akkumuleres først i en ionfælde, typisk i et tiendedel sekund, når en 10 Hz pulseret laser bruges til fotoexcitation. Herefter accelereres de igennem et spændingsfald på 22 kV, og ioner med det ønskede masse/ladningsforhold (m/z) udvælges med magneten og injiceres i ringen.
Ionerne føres rundt i ringen vha. elektriske felter. Ringens omkreds er 8.4 meter, hvilket betyder, at ionerne har omløbstider af størrelsesordenen 10 til 100 ms afhængig af deres masse og ladning. Uden ydre påvirkning er ionernes levetid bestemt af restgastrykket i ringen, da kollisioner fører til dissociation eller elektrontab. Trykket af restgas, mestendels brint, er omkring 10-11 mbar. Et ikke-ladet fragment mærker ikke de elektriske felter og bevæger sig derfor i den retning, dens moderion havde. Neutrale atomer eller molekyler, som dannes i midterområde 1 (figur 3), fortsætter ligeud og rammer detektoren placeret for enden af banen. I eksperimentet tælles de neutrale produkter som funktion af tiden. Et sådant kollisionsafhængigt henfald er eksponentielt med en tidskonstant på nogle få sekunder (figur 4). Ionerne kan imidlertid belyses i den anden side af ringen (område 2 i figur 3), og hvis de fotoexciterede ioner har nok energi til at gå i stykker af sig selv, måles et større tælletal i detektoren pga. forsinket dissociation.
AMP-ioners levetid mht. dissociation efter UV-bestråling
I figur 5 er levetidsspektret for AMP-anionen efter absorption af en 266 nm foton vist [9]. Tidskonstanten for dissociation af de varme ioner er 16 ms. I dissociationen dannes adenosin-nucleosidet og PO3-, hvilket kræver 1.3 eV ifølge tærskelværdimålinger af Yo og Kebarle [10]. Vores data tillader os at konkludere, at fotodissociation er irrelevant, når ionerne befinder sig i opløsning, hvor de afgiver varmen i løbet af picosekunder.
Det er muligt, at en brøkdel af ionerne dissocierer via direkte ikke-statistiske processer på submikrosekund tidsskala, men instrumentets tidsopløsning er ikke tilstrækkelig til at måle disse. Dog kan betydningen af sådanne processer vurderes indirekte. Vi kan nemlig måle brøkdelen af ioner, der i alt fjernes fra ionstrålen som følge af laserpulsen og sammenholde dette tal med brøkdelen, som fjernes via den statistiske proces med tidskonstant på 16 ms. Det er nærmere beskrevet i reference [9] og bygger på simple eksponentielle henfald. Disse brøkdele er afbildet på figur 6 som funktion af laserpuls-energien målt i mJ. Destruktionen af ioner vokser lineært med pulsenergien for lave energier lige indtil mætning, hvor alle ioner i vekselvirkningsområdet har absorberet en foton. Der er en stor usikkerhed på dataene, men vi kan konkludere, at den dominerende del af ionerne (80 ± 20%) dissocierer via en statistisk proces, da de to datasæt næsten er sammenfaldende.
I et andet eksperiment blev AMP-kationen (protoniseret adenin og neutral phosphorsyregruppe) bestrålet med UV-lys [9]. Igen blev levetiden for statistisk dissociation målt til 16 ms, men i dette tilfælde dominerer ikke-statistiske processer (figur 6). Langt mindre end 1% af ionerne dissocierer via en statistisk reaktionskanal. Det koniske krydsningspunkts topologi [11] kan være ændret således, at fotoexcitation nu fører til prompte dissociation i stedet for tilbagevenden til grundtilstanden for AMP-kationen.
Endnu færre ioner dissocierer via en anden kanal med en tidskonstant på 146 ms (figur 5), der tilskrives krydsning til en lavereliggende triplettilstand, T1, efter excitation til S1. Krydsning fra T1 til S0 er spinforbudt og er flaskehals for dissociationen.
Slutbemærkninger
I vandig opløsning afhænger AMP’s ioniseringsform af pH-værdien. Protoniseret adenins pKa-værdi er 4.1, og ved neutral pH er nucleobasen derfor neutral. Dvs. i et biologisk miljø er AMP-anionen den dominerende form. Eksperimenterne viser, at der kan ses bort fra statistisk unimolekylær dissociation (mikrosekundtidsskala) efter fotoexcitation, da ionerne er kølet ned inden vekselvirkninger med vandmolekyler (picosekundtidsskala). Samtidig er ikke-statistiske dissociationsprocesser negligerbare for anionerne, hvilket er i fin overensstemmelse med en ultrakort levetid af den exciterede tilstand (få hundrede femtosekunder). Deexcitationen sker højst sandsynligt via et konisk krydsningspunkt (mere nøjagtigt: sloped conical intersection [11]). Det støtter hypotesen om, at nucleobasers fotostabilitet har været vigtig for arvematerialets dannelse og dermed forudsætningen for liv på jorden. Fremtidige målinger på oligonucleotider er planlagte for at få flere detaljer om energitransportprocesserne i DNA og RNA.
Taksigelser
En stor tak rettes til mine samarbejdspartnere på Aarhus Universitet omkring dette projekt: Jens Ulrik Andersen, Preben Hvelplund, Shigeo Tomita, Ulrik V. Pedersen og Liu Bo samt James S. Forster fra Université de Montréal.
Referencer
1. C. E. Crespo-Hernámdez, B. Cohen, P. M. Hare, B. Kohler, Chem. Rev. 104, 1977-2019 (2004).
2. J.-M. L. Pecourt, J. Peon og B. Kohler, J. Am. Chem. Soc. 122, 9348-9349 (2000).
3. J.-M. L. Pecourt, J. Peon og B. Kohler, J. Am. Chem. Soc. 123, 10370-10378 (2001).
4. J. D. Watson og F. H. C. Crick, Nature 171, 737-738 (1953).
5. Koniske krydsningspunkter har vist sig at forekomme hyppigere end hidtil antaget, og deres identifikation er i dag noget, der optager mange kvantekemikere. Et indlysende krav er mindst tre atomer i molekylet, men det vil føre for vidt i denne artikel at give en detaljeret kvantekemisk beskrivelse; i stedet henvises interesserede til denne netop udkomne bog: W. Domcke, D. R. Yarkony og K. Köppel, Conical Intersections: Electronic structure, Dynamics and Spectroscopy, World Scientific, Singapore (2004).
6. N. Ismail, L. Blancafort, M. Olivucci, B. Kohler og M.A. Robb, J. Am. Chem. Soc. 124, 6818 (2002).
7. S. P. Møller, Nucl. Instrum. Methods Phys. Res., Sect. A. 394, 281-286 (1997).
8. J. U. Andersen, P. Hvelplund, S. Brøndsted Nielsen, S. Tomita, H. Wahlgreen, S. P. Møller, U. V. Pedersen, J. S. Forster og T. J. D. Jørgensen, Rev. Sci. Instrum. 73, 1284-1287 (2002).
9. S. Brøndsted Nielsen, J.U. Andersen, J.S. Forster, P. Hvelplund, B. Liu, U.V. Pedersen og S. Tomita, Phys. Rev. Lett. 91, 048302 (2003).
10. Y. Ho og P. Kebarle, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 165, 433-455 (1997).
11. Når et minimum på den exciterede tilstandsoverflade indtræffer før krydsningspunktet (på engelsk betegnes dette et sloped conical intersection), dannes der ikke fotoprodukter. I modsat fald (peaked conical intersection) konkurrerer dannelse af fotoprodukter med deexcitationen.
Figur 1. Strukturen af AMP-nucleotidanionen.
Figur 2. Watson-Crick basepar.
Figur 3. Lagerringen ELISA. Se tekst for detaljer.
Figur 4. AMP-anionens levetidsspektrum. Det eksponentielle henfald på sekundtidsskala skyldes kollisioner med restgas i ringen. Det hurtige henfald inden for de første tyve millisekunder er fra metastabile ioner med høj indre energi, der stammer fra kollisionsaktivering ved overførsel fra ionkilden til ringen.
Figur 5. AMP-ioners levetid efter absorption af en 266 nm foton. Ionerne blev belyst efter 80 millisekunders lagringstid. De blå data er for anionen, mens de røde er for kationen. Levetiden på de 16 ms for kationen er bestemt i et andet eksperiment nærmere beskrevet i reference [9]. Afstanden mellem de diskrete punkter er ionernes omløbstid i ringen (75 ms).
Figur 6. Afbildning af den total procentdel af AMP-ioner der fotodissocierer (fyldte cirkler), og procentdelen der dissocierer via en statistisk proces (åbne cirkler) som funktion af laserlysets pulsenergi. Bemærk at for kationen er brøkdelen for den statistiske proces multipliceret med 450.
