Enzymkatalyserede reaktioner i organiske solventer har utallige potentielle anvendelser. De kan f.eks. bruges til at modificere fedtsyresammensætningen i phospholipider ved at forbedre fysiske og kemiske egenskaber såsom emulgatoregenskaber og oxidationsstabilitet.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2005 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Anders Falk Vikbjerg og Xuebing Xu, Food Biotechnology and Engineering Group, BioCentrum-DTU, DTU
I en lang række projekter på BioCentrum-DTU under Levnedsmiddelcentret (LMC) i Food Biotechnology and Engineering Group arbejdes der på vha. enzymteknologi at udvikle nye produkter og teknologier inden for lipidområdet. Ud over lipidmodifikation er oprensning af lipider og separationsprocesser en del af forskningsområdet.
Anvendelse af enzymer til modifikation af lipider har flere fordele sammenlignet med kemisk syntese. Enzymatiske reaktioner giver ofte færre biprodukter, da enzymerne er meget specifikke i deres katalytiske aktivitet, og de kan bruges til både hydrolyse- og syntesereaktioner. Forskellige enzymreaktorer og -processer har i forskellig skala inkl. batchreaktorer og pakkede kolonner været anvendt til produktion af diverse lipidprodukter. Faciliteter på BioCentrum muliggør opskalering af processer fra laboratorie- til pilotskala.
Et af de igangværende projekter er enzymkatalyseret produktion af phospholipider med ændret fedtsyreprofil (strukturerede phospholipider). Phospholipider bruges bl.a. som emulgatorer i levnedsmiddelprodukter, som liposomer i den farmaceutiske industri og som lotioner i kosmetikindustrien.
Indtil nu har der været relativt få forsøg på at optimere de funktionelle egenskaber ved at ændre fedtsyresammensætningen.
Phospholipidkemi og -anvendelser
Phospholipider (PL) inddeles normalt i to grupper: glycero- og sphingophospholipider. Glycerohospholipider har den største kommercielle anvendelse i form af lecitin (blanding af glycerophospholipider). Figur 1 viser de kemiske strukturer af glycerophospholipider. I glycerophospholipider er rygraden i molekylet glycerol, der via to esterbindinger er koblet med to fedtsyrer på sn-1- og sn-2-positionen. På sn-3-positionen ses en phosphorsyrerest, der oftest er forsynet med en substituent. Hovedparten af industrielt anvendt lecitin er et biprodukt fra sojaolieproduktionen og består primært af phosphatidylcholin (PC). Phospholipiderne fjernes fra den rå olie ved en aflecitineringsproces (degumming). Dette skyldes, at deres stærkt emulgerende egenskaber og reaktioner under opvarmning vil mørkfarve olien under forarbejdning. Sojalecitin tilsættes normalt til levnedsmidler som margarine, bagværk, chokolade, overtræk på konfekt og diverse mælkeprodukter, hvor de fungerer som emulgatorer. I de fleste tilfælde er kun små mængder (<2%) phospholipid nødvendig.
Phosphatidylcholin har en vigtig rolle i human cellefunktion og menes at være forbundet med en lang række helbredsmæssige egenskaber. Det er en kilde til cholin, som også findes i neurotransmitteren acetylcholin, der er nødvendig for normal hjernefunktion. Derfor har phosphatidylcholin været brugt i studier af neurologiske og psykiske sygdomme [1].
Phospholipiderne har efterhånden fået større anvendelse i lægemiddelindustrien, da de har vist sig i form at liposomer at være velegnede som »drug carriers«. Når phospholipiderne blandes i en vandig opløsning, finder de sammen og danner liposomer. Liposomer har form som hule skaller, der af sig selv finder sammen og folder sig til runde mikroskopiske sfærer [2]. Der findes allerede godkendte og markedsførte medicinske liposomer, som kan lastes med diverse lægemidler og sendes ind i blodbanen [3].
Hvorfor udskifte fedtsyrerne i phospholipider?
Fedtsyrerne i naturligt forekommende phospholipider varierer i kædelængde (C12-C22) og mætningsgrad (antal dobbeltbindinger på fedtsyrerne). Interessen for at ændre på phospholipidernes struktur er stigende. Strukturændringer resulterer i ændret funktionalitet. Ved udveksling af fedtsyrerne er det muligt at forbedre fysiske og kemiske, ernæringsmæssige, farmaceutiske og medicinske egenskaber. Især inkorporering af polyumættede fedtsyrer fra fiskeolie har af helbredsmæssige grunde fået øget opmærksomhed. Desuden har disse PL vist potentiale i behandling af kræft [4]. De naturligt forekommende polyumættede fedtsyrer kan også udskiftes med mættede fedtsyrer for at øge den oxidative stabilitet i eksempelvis emulsioner [5]. Når valproinsyre (antiepileptika) ved kemisk syntese indsættes på phospholipidernes sn-2-position, bliver lægemidlerne mere effektive ved lavere koncentrationer, sammenlignet med de mængder der normalt anvendes [4]. De lavere koncentrationer reducerer de toksikologiske risici og nedsætter risikoen for interaktion med andre lægemidler. Højere koncentrationer af phospholipidnedbrydende enzymer ses oftest ved epilepsi, smerter, migræne og i kræftceller [2,4].
Enzymatisk modifikation af phospholipider
Adskillige enzymer kan bruges til at modificere phospholipider (figur 2). Lipaser, phospholipase A1 og A2 anvendes ved enzymatisk udskiftning af fedtsyrerne i phospholipiderne. Phospholipase A1 og lipaser hydrolyserer esterbindingen i sn-1-positionen, mens phospholipase A2 hydrolyserer esterbindingen i sn-2-positionen. Alternativt kan den polære gruppe på phospholipidernes sn-3-position modificeres med phospholipase C og D.
Industrielle enzymer som lipaser produceres ved fermentering af mikroorganismer, mens phospholipaser findes i gift fra slanger, edderkopper, og bier. Kommercielt phospholipase A2 er hovedsageligt oprenset fra svinebugspytkirtler. Af proceshensyn er det mest hensigtsmæssigt at anvende immobiliserede enzymer, da det muliggør genanvendelse og letter separationen af enzym fra det ønskede produkt. Af de omtalte enzymer er det kun lipaser, der på nuværende tidspunkt kan købes på immobiliseret form.
Industriel enzymatisk modifikation af phospholipider
Adskillige udenlandske firmaer bruger enzymkatalyseret produktion af lysophospholipider (lysoPL) – heriblandt Degussa og Loders Croklaan [7-8].
LysoPL er en delvist hydrolyseret phospholipid med en fedtsyre. LysoPL kan have fedtsyrer på sn-1- eller sn-2-positionen. Hydrolyse af PL med PLA2 giver lysoPL med fedtsyrer på sn-1-positionen, og hydrolyse med PLA1 eller sn-1,3-specifikke lipaser danner lysoPL med fedtsyrer på sn-2-positionen. LysoPL bruges i en lang række levnedsmidler, kosmetikprodukter og medicinalvarer. Stofferne er mere hydrofile, har i visse tilfælde bedre emulgatoregenskaber ved lavt pH, højere saltkoncentrationer og højere temperaturer end det oprindelige PL-materiale [9].
Udskiftning af fedtsyrerne kan ske i et eller to trin. I den totrins lipasekatalyserede proces fjernes den oprindelige fedtsyre på sn-1-positionen ved hydrolyse. Lysophospholipiderne isoleres, og i andet trin esterificeres de med den ønskede fedtsyre. I ettrins-processen sker hydrolyse og esterificering samtidig. At udføre reaktionerne i to trin giver produkter med højere renhed, da ettrins-processen giver produkter med en blanding af de oprindelige og de ønskede fedtsyrer. I ettrins-reaktionen tilsættes høje mængder af den ønskede fedtsyre for at udkonkurrere de oprindelige fedtsyrer. Indtil nu har esterificeringsreaktionerne kun været udført i lille skala, og udfordringerne ligger i at optimere processerne til potentiel industriel anvendelse.
Problemer og udfordringer
Ved enzymkatalyseret udskiftning af fedtsyrerne i phospholipiderne ses normalt et fald i udbyttet ved stigende inkorporering af nye fedtsyrer [10]. Det skyldes hovedsageligt sideløbende hydrolyse i reaktionssystemet. Det er vigtigt at overveje enzymmængde, fedtsyremængden, vandindhold/vandaktivitet, mængde af solvent, reaktionstemperatur og -tiden. Hydrolyse- og syntesereaktionerne påvirkes forskelligt af de omtalte parametre, og det er muligt at optimere reaktionssystemet, så der opnås både høj inkorporering af nye fedtsyrer og højt udbytte af phospholipiderne.
Den enzymkatalyserede udskiftning af fedtsyrerne på phospholipiderne har hovedsageligt været udført med lipaser og phospholipase A2 ved tilstedeværelse af organiske solventer såsom n-hexan og toluen [10]. Alternativt anvendes der et solventfrit system, hvor fedtsyrerne ud over at fungere som acyldonor også fungerer som opløsningsmiddel. Brugen af solventer øger reaktiviteten pga. lavere viskositet og øget massetransport. Solventets polaritet har stor betydning for enzymets katalytiske aktivitet. Høj polaritet fjerner bundet vand fra enzymet, hvorefter den katalytiske aktivitet sænkes [11]. Optimering af solvent og solventfrit system er udført i vores laboratorium, og begge systemer giver omtrent samme udbytte under optimerede betingelser. Dog påvirker de omtalte parametre systemerne meget forskelligt. I et solventfrit system ses inhibering ved høje mængder frie fedtsyrer, mens dette ikke er tilfældet i solventsystemet. Store mængder fedtsyrer vanskeliggør den efterfølgende oprensning. Andre problemer er, at det normalt er nødvendigt at have store enzymmængder for effektivt at inkorporere nye fedtsyrer. Ved høje enzymdoser (>50 vægt% baseret på substratmængde) har reaktionsblandingen svært ved at blande, især i det solventfri system.
Vand opretholder enzymets struktur i reaktionssystemet, og samtidig har det indflydelse på reaktionshastigheden, produktudbyttet og enzymets stabilitet. For høje mængder vand fører i solventsystemet til øget hydrolyse, mens det i det solventfri system fører til inhibering af syntese- og hydrolysereaktionerne. Mættede saltopløsninger har sædvanligvis været brugt til at regulere vandaktiviteten i laboratorieforsøg. Det er ikke praktisk ved opskaleret produktion, og der skal udtænkes nye, alternative metoder til at kontrollere vandindholdet i systemet.
Temperaturen er også en vigtig parameter ved enzymatisk udveksling af fedtsyrerne. Substraternes viskositet reduceres ved høje temperaturer, hvilket resulterer i øget massetransport og derved øget reaktionshastighed. Reaktionstemperaturer skal dog vælges efter enzymernes termostabilitet. Ved for høje temperaturer denaturerer enzymet irreversibelt, hvilket reducerer dets præstation.
Selv om brugen af organiske solventer har gjort enzymatisk acylmodifikation af phospholipider mere realiserbar, er der stadig opgaver, der skal løses for at reaktionerne kan blive kommercielt attraktive i større skala. Reaktionsparametrene skal vælges med omhu, ellers vil sideløbende hydrolyse i systemet resultere i lavt udbytte.
Det omtalte ph.d.-projekt er finansieret af Statens Teknisk-Videnskabelige Forskningsråd, og projektleder er lektor Xuebing Xu. Hovedmålene med projektet er at belyse reaktionssystemer og udvikle nye processer til produktion af strukturerede phospholipider til potentiel industriel anvendelse. Et antal videnskabelige artikler er i forbindelse med projektet blevet publiceret eller indsendt til diverse tidsskrifter. Under ledelse af lektor Xuebing Xu er andre nye projekter om modifikation af phospholipider ved anvendelse af enzymteknologi blevet igangsat.
Referencer:
1. Farooqui, A.A.; Horrocks, L.A.; Farooqui, T.(2000): Gycerophospholipids in brain: their metabolism, incorporation into membranes, functions, and involvement in neurological disorders, Chem. Phys Lipids 106,1
2. http://www.liplasome.com
3. Lægemiddelkataloget: http://www.lk-online.dk
4. Kozak, A. (2001): Phospholipid derivatives of valproic acid and mixtures therof, US patent 6,313,106.
5. Jenski, L.J., Zerouga, M., Stillwell, W. (1995): Omega-3 fatty acid-containing liposomes in cancer therapy, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 210:227
6. Pedersen, K.B. (2001): Interesterfication of phospholipids, US patent 6,284,501
7. http://www.degussa-food-ingrdients.com
8. http://www.croklaan.com
9. Colarow, L., Masson, G., Trueck, H.U., Heat-stable oil and water emulsion and preparation thereof, US patent 5,314,706
10. Adlercreutz, P., Lyberg, A.-M., Adlercreutz, D. (2003): Enzymatic fatty acid exchange in glycerophospholipids, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105:638.
11. Klibanov, A.M. (2001): Improving enzymes by using them in organic solvents, Nature, 49:241.
Figurer:
Figur 1. Struktur af naturlige glycerophospholipider. R1 og R2 refererer til fedtsyrer og x refererer til en substituent bundet til en phosphatgruppe.
Figur 2. Hydrolytisk aktivitet af forskellige phospholipider og lipaser. PLA1, phospholipase A1; PLA2, phospholipase A2; PLC, phospholipase C og PLD, phospholipase D.
Figur 3. Lipasekatalyseret udskiftning af fedtsyre på phospholipidets sn-1-position.
