Ionchromatografi er et stærkt værktøj til kvalitativ og kvantitativ analyse af an- og kationiske species. Det kan bl.a. udnyttes ved bestemmelsen af ioner i miljø- og fødevareprøver.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 9, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Joachim Weiss, Dionex GmbH, Tyskland
Artiklen er baseret på et indlæg på konferencen: »Second Annual Excutive Seminars in Analytical Chemistry«, 9.-10. april 2002 på Marriott Hotel i København.
Bestemmelse af ioner i miljø- og fødevareprøver er et klassisk analytisk problem, der kan løses på forskellige måder. Konventionelle vådkemiske metoder såsom titrering, fotometri, gravimetri, turbidometri og kolorimetri er alle arbejdsintensive, tager lang tid og er lejlighedsvis problemfyldte. I modsætning til dette er ionchromatografi (IC) hurtig, følsom, selektiv og giver samtidig detektion. Da antallet af analyser, pga. miljøet og stigende omkostninger ved fødevarer af høj kvalitet, er steget mærkbart, er den nødvendige analysetid blevet et vigtigt aspekt af analysemetoden.
Efter introduktionen af meget effektive ionbytningskolonner er det lykkedes at reducere den nødvendige analysetid drastisk. I dag kan uorganiske kat- og anionprofiler derfor opnås på under 10 minutter, en brøkdel af den tid, der før var nødvendig med de traditionelle vådkemiske metoder. Med højfølsom undertrykt ledningsevnedetektion [1] kan ioner detekteres i mg/L-koncentrationer uden opkoncentrering. Dvs. man kan analysere prøver fra komplekse matricer ved at fortynde disse, så koncentrationen af matrixkomponenter gøres mindre. De ionchromatografiske metoders selektivitet ved analyse af uorganiske og organiske anioner sikres ved at vælge en passende ionbytterkolonne. I modsætning til de silicabaserede kolonner, der sædvanligvis bruges ved konventionel omvendtfase-chromatografi, bruges der oftest resiner som f.eks. polystyren/divinylbenzencopolymerer. Disse materialers store pH-stabilitet tillader brug af stærke syrer og baser som eluenter, hvilket er forudsætningen for metodens anvendelighed over et bredt område. Samtidig er de fleste organiske polymerer kompatible med organiske opløsningsmidler som methanol og acetonitril, der kan bruges til at fjerne organiske forureninger. Polymerbaserede kolonner udviser derfor lav følsomhed over for komplekse matricer som vand og fødevarer, og prøveforberedelsen kan ofte reduceres til en simpel fortynding med deioniseret vand efterfulgt af en filtrering.
Betydningen af iochromatografi i miljøanalyse
Miljøanalyse er et af de vigtigste anvendelsesområder for ionchromatografi. Hovedanvendelsesområdet inden for analytisk miljøkemi er kvalitativ og kvantitativ analyse af an- og kationer i al slags vand. I figur 1 ses separation af anioner i postevand vha. to forskellige stationære faser. Chromatogram A viser separation, på en konventionel latexeret anionbytter stationær fase, vha. en carbonat/bicarbonateluent. De tre vigtigste komponenter kan adskilles på under 8 minutter. På den anden side er kvantiteringen af fluoridioner problematisk, da disse kommer med dødvoluminet. En mærkbart bedre resolution mellem fluorid og dødvoluminet opnås med en 5-µm IonPac AS14A stationær fase vha. carbonat/bicarbonateluent i et andet forhold. Chromatogram B fås vha. en hydroxidselektiv anionbytter med en KOH-koncentrationsgradient som eluent. Den signifikant højere følsomhed skyldes den markant lavere baggrundsledningsevne, samt at gradienten fokuserer de chromatografiske toppe (de bliver skarpere) i modsætning til de isokratiske systemer. Følsomhedsforbedringen er af stor betydning ved analyse af orthophosphat, der uden problemer kan kvantiteres på sporstofniveau . Den store resolution mellem fluorid og dødvoluminet under disse chromatografiske betingelser gør det muligt at kvantitere fluorid – selv i husholdningsspildevand – med en genfinding på ca. 100%.
UV- og ledningsevnedetektion i serie
Højkapcitetsanionbyttere er vigtige ved analyse af spildevand. Figur 2 demonstrerer dette på spildevand, der indeholder store mængder chlorid. Selv om de vigtigste komponenter detekteres vha. undertrykt ledningsevne (chromatogram A), er UV-detektion væsentligt mere selektiv for nitrit, nitrat og bromid (chromatogram B). Med højkapacitetsanionbyttere med undertrykt ledningsevnedetektion kombineret med UV-detektion kan der analyseres koncentrationsforskelle mellem chlorid og nitrat på op til 100.000:1. Detektionsmetoderne bruges normalt i serie for at få mest mulig information pr. injektion, hvorved der spares tid (og penge). Ionbyttere med lavere kapacitet bliver overbelastede, hvis der analyseres for begge ioner på én gang.
Sporstofniveaubestemmelse af bromationer
En meget krævende brug er sporstofniveaubestemmelse af bromationer i drikkevand. Bromationerne opstår som biprodukt når drikkevand desinficeres vha. ozon, og de mistænkes for at være carcinogene, selv ved lave µg/L-niveauer [2]. WHO, USAs EPA og EU overvejer grænseværdier for bromat i drikkevand på mellem 10 µg/L og 25 µg/L [3,4]. Ionchromatografi gør det muligt at foretage kvantitativ sporstofniveauanalyse af bromationer vha. flere forskellige teknikker. Den nyeste af disse (Wagner et al. [5]) er baseret på derivatisering efter kolonnen med o-dianisidin med efterfølgende fotometrisk detektion ved 450 nm. Metoden kan kombineres med EPA-metode 300.1 (Part B) [5], der beskriver separation af bromat, bromid, chlorid og chlorit. Ifølge forfatteren er detektionsgrænsen for bromat ca. 0.5 µg/L. Alternativt kan man anvende masse-selektiv detektion ved at forbinde ionchromatografen med et massespektrometer, f.eks. en quadrupol MS vha. et elektrospray interface (ESI) [6]. Med selektiv ionmonitering (SIM, Selective Ion Monitoring) kan bromat (m/z = 127) detekteres med høj følsomhed og specificitet (figur 3).
Bestemmelse af de fem haloeddikesyrer
Et andet vigtigt anvendelsesområde for masseselektiv detektion ved IC er bestemmelsen af de fem haloeddikesyrer (mono-, di, trichloreddikesyre og mono- og dibromeddikesyre), der også er desinfektionsbiprodukter i drikkevand specificeret efter U.S. EPA-Metode 552.1 og 552.2 med GC-ECD (ECD, Electon Capture Detection). Alternativt [7] kan haloeddikesyrerne separeres vha. IC [8] med en hydroxidselektiv anionbytter med meget hydrofile ionbytteregenskaber. Som mobil fase anvendes en hydroxidgradient. En 2 mm diameter kolonne forbindes, så eluenten passerer et membranbaseret suppressorsystem (ASRS, eksternt vand setup), der konverterer hydroxideluenten til vand, før den ledes ind i ESI-interfacet. Methanol (90%) tilsættes efter kolonnen for at forøge følsomheden. Under disse betingelser kan haloeddikesyrerne uden problemer detekteres på 1-µg/L-niveau .
Kationanalyser
Ved kationanalyse giver moderne 5-µm svagt sure kationbyttermaterialer samtidig analyse af alkali- og jordalkalimetaller på mindre end 5 minutter. Men forholdet mellem natrium- og ammoniumioner i miljøprøver er ofte større end 1000:1, hvilket er et problem, da ionernes toppe eluerer tæt ved hinanden. Derfor er der udviklet højkapacitets kationbyttermaterialer, så der kan analyseres sporstofmængder af ammoniumioner, selvom der er alkali- og jordalkalimetaller til stede i store mængder (figur. 4). Da højkapacitets kationbyttermaterialer kræver eluenter med stor ionstyrke, er det imperativt at anvende et suppressor-system til at undertrykke baggrundsledningsevnen. Mikropore kationbytterkolonner i størrelsen 100 mm x 2 mm i.d. er udviklet mhp. sammenkobling med ESI-MS. Anvendelse af masseselektiv detektion inden for kationanalyse inkluderer screening for uorganiske kationer og analyse af polære, hydrofile aminer. Positiv identifikation af analytter og den større følsomhed ift. undertrykt ledningsevnedetektion pga. større signalstabilitet og elimination af ioniseringssupression er de væsentligste fordele ved IC-MS-kationanalyse.
Ionchromatografis betydning for analyse af føde- og drikkevarer
Det er føde- og drikkevareindustriens opgave at levere velsmagende og sunde produkter med veldefineret næringsværdi og lagerkvalitet til kunderne. Fremstillings- og moniteringsprocesserne er delvist automatiseret, dvs. det kun er nødvendigt med nogle få, enkle kvalitetstests. I nogle tilfælde er det dog påkrævet at udføre dyre analyser mhp. kvalitetssikring. Her tillader ionchromatografi, selv i komplekse matricer, hurtig og præcis bestemmelse af både uorganiske og organiske anioner. IC-analyser kræver kun minimal prøveforberedelse. Prøverne ekstraheres i udstrakt grad med deioniseret vand og membranfiltreres (0.45 µm) før de injiceres direkte i det chromatografiske system. brugen af IC omfatter alkali-jordalkalimetaller, overgangsmetaller, organiske syrer, aminer, carbohydrater, alkoholer og aminosyrer.
Analyse af mælk og babymad
Iodidionmonitering i mælk og babymad er et vigtigt anvendelsesområde [9], da for meget iodid kan føre til skjoldbruskkirtelrelaterede sygdomme. For at forlænge kolonnernes levetid anbefales det at fjerne mælkeproteiner fra prøverne før den chromatografiske analyse. Det kan gøres ved fældning med salpetersyre med efterfølgende filtrering og dernæst en fastfaseekstraktionskolonne. Iodidseparationen udføres vha. anionbytningschromatografi på en hydroxidselektiv stationær fase og en salpetersyreeluent. For at opnå tilstrækkelig præcision bruges DC-amperometri med en Af-arbejdselektrode. Figur 5 viser en separation af iodidioner i mælke- og sojabaseret babymad . Detektionsgrænsen for iodidioner er ca. 3 µg/L. Den relative standardafvigelse på toparealet er 3% for seks på hinanden følgende injektioner.
Emulsionsstabilisatorer
IC kan også bruges til at separere ioner med højere molekylmasse såsom polyphosphater. De anvendes f.eks. i ost som emulsionsstabilisatorer. Kommercielle polyphosphater er blandinger af kondenserede phosphater, der varierer i kædelængde. Variationen kan karakteriseres ved separation på en hydroxidselektiv anionbytterkolonne i mikroporeform vha. en hydroxidkoncentrationsgradient med undertrykt ledningsevnedetektion [10]. I figur 6 ses chromatogrammerne for to forskellige osteprodukter. De viser en forskellig grad af hydrolyse af polyphosphaten under fremstillingsprocessen, som kan optimeres vha. IC.
Sulfitdetektion i alkoholholdige drikkevarer
DC-amperometri bruges også til detektion af sulfit i alkolholdige drikkevarer som vin og øl. Sulfit oxideres let på en Pt-arbejdselektrode ved 0.6 V. Når sulfit separeres ved ioneksklusionschromatografi, kan glycerol og ethanol bestemmes i samme arbejdsgang. Separation af det relativt komplekse spektrum af organiske syrer i vin og frugtjuice er derimod en udfordring. Desuden er der store koncentrationsforskelle for f.eks. citron- og isocitronsyre i appelsinjuice, hvilket gør isokratisk eluering på ionbytterkolonner meget svær, idet toppenes renhed (peak purity) ikke er sikret. Selv på konventionelle anionbytterkolonner, designet mhp. gradienteluering med en hydroxideluent, opnås ikke tilstrækkelig resolution mellem de tidligt eluerende monocarboxylsyrer. Dette problem kan kun løses ved at anvende højkapacitetsanionbyttere. 100% solventkompatibiltet tillader brug af methanol ved optimering af selektiviteten, særlig ved separation af vinsyre fra mineralsyrer, der eluerer meget tæt på vinsyren. Den eneste ulempe ved sådanne separationer er de relativt lange analysetider på omkring 40 minutter.
Analyse af kulhydrater i juice
Derudover anvendes IC ved analyse af kulhydrater i juice [11], alkoholholdige drikkevarer [12], honning [11,13] og kunstige sødemidler. I stærkt basiske medier danner kulhydrater anioner, der kan separeres på højkapacitetsionbyttere med en hydroxideluent. Som detektion anvendes pulsamperometri på en Au-arbejdselektrode. Da sukkeralkoholer og mono-, di- og oligosaccharider udviser meget forskellig retention, er selektiviteten af de respektive separatorkolonner optimeret til at give optimal resolution for de forskellige grupper af kulhydrater. Anionbytningschromatografi er med succes blevet brugt til at afsløre forfalskning af frugtjuice med invertsukker og glucosesirup. I begge tilfælde udviser oligosaccharidsammensætningen forskellige mønstre. Det er derfor muligt at detektere tilsætning af mindre end 1% sukker ved at kvantitere oligosacchariderne [14].
Konklusion
Ionchromatografi er et stærkt værktøj til kvalitativ og kvantitativ analyse af an- og kationiske species. Takket være meget effektive separationsmaterialer er det ved direkte injektion muligt at detektere stoffer i det lave µg/L-koncentrationsområde. Metodens store følsomhed tillader fortynding af prøver fra komplicerede matricer, så interferens fra matrixkomponenter minimeres. Analyse for alskens ioner inden for miljøområdet af vand-, jord- og luftprøver såvel som drikke- og fødevarer er to meget vigtige anvendelsesområder for ionchromatografi.
Artiklen er indsendt på opfordring af og oversat af redaktionen for Dansk Kemi.
Referencer
1. J. Weiss, Ionenchromatographie. 3rd ed. Wiley-VCH Weinheim 2001.
2. Y. Kurokawa; Y. Maekawa, M. Takahashi, and Y. Hayashi, Environ. Health Perspect. 87 (1990) 309.
3. World Health Organization: guidelines for drinking water quality. WHO Geneve 1993.
4. Commission of the European Communities: Proposal for a council directive concerning thequality of water intended for human consumption. Brussels 1994.
5. H.P. Wagner, B.V. Pepich, D.P. Hautman, and D.J. Munch, J. Chromatogr. A 850 (1999) 119.
6. M. Nowak and A. Seubert, Anal. Chim Acta 359 (1998) 193.
7. N.K. Kristiansen, K.T. Aune, M. Foeshaug, G. Becher, and E. Lundanes, Water Res. 30 (1996) 2155.
8. C. Sarzanini, M.C. Bruzzoniti, and E. Mentasti, J. Chromatogr. A 850 (1999) 197.
9. F. Gaucheron, Y. le Graet, M. piot, and E. Boyaval, Lait 76 (1996) 433.
10. E. Baluyot and C.G. Hartford, J. Chromatogr. 739 (1996) 217.
11. B. Baumgärtner, Diploma Thesis, Fachhochschule Fresenius, Wiesbaden 1989.
12. H. Klein and R. Leubolt, J. Chromatogr. 640 (1993) 259.
13. K.W. Swallow and N.H. Low, J. Agric. Food Chem. 38 (1988) 1828.
14. A. Trotzer, H.-J. Hofsommer, and K. Rubach, Flüssiges Obst 1 (1991) 13.
Figur 1. Analyse af anioner i vandværksvand. – Separationskolonner: (A) IonPac AS4A-SC, (B) IonPac AS17; eluenter: (A) 1.7 mmol/L NaHCO3 + 1.8 mmol/L Na2CO3, (B) 1 mmol/L KOH isokratisk for 1.5 min, så lineært til 20 mmol/L på 3.5 min, så til 40 mmol/L på 2 min; flowhastigheder: 2 mL/min; detektion: undertrykt ledingsevne; 25 µL vandværksvand injiceret ufortyndet; solutkoncentrationer: (A) 0.06 mg/L fluorid (1), 24.1 mg/L chlorid (2), 0.01 mg/L nitrit (3), 0.02 mg/L bromid (4), 1.48 mg/L nitrat (5), 31.4 mg/L sulfat (6) og 0.29 mg/L orthophosphat (7), (B) 0.05 mg/L fluorid (1), 21.5 mg/L chlorid (2), 0.015 mg/L nitrit (3), 0.03 mg/L bromid (4), 1.41 mg/L nitrat (5), 29.7 mg/L sulfat (6) og 0.48 mg/L orthophosphat (7).
Figur 2. Anionanalyse i spildevand med samtidig ledningsevne- og UV-detektion. – Separationskolonne: IonPac AS9-HC; eluent: 9 mmol/L Na2CO3; flowhastighed: 1 mL/min; detektion: (A) undertrykt ledningsevne, (B) UV (214 nm); 25 µL injiceret; solutkoncentrationer: 1.14 mg/L fluorid (1), acetat (2), 2 g/L chlorid (3), 0.14 mg/L nitrit (4), 0.82 mg/L bromid (5), 1.5 mg/L nitrat (6), 21.1 mg/L orthophosphat (7) og 30.3 mg/L sulfat (8).
Figur 3. Bestemmelse af bromid i drikkevand vha. IC-MS. – Separationskolonne: IonPac AS9-HC (2-mm); eluent: 9 mmol/L Na2CO3; flowhastighed: 0.25 mL/min; 50 µL injiceret; detektion: (A) undertrykt ledningsevne, (B) Negativ ESI-MS, SIM, m/z = 127, source: 10 V, ESI probe: 275°C, -2.5 kV, Boxcar smoothing, 15 punkter; solutkoncentrationer: 22 µg/L bromat (1), dichloreddikesyre (ikke kvantiteret, 2).
Figur 4. Uorganiske kationer i drikkevand med højkapacitets kationbytter. – Separationskolonne: IonPac CS16; eluent: 30 mmol/L MSA; flowhastigehd: 1 mL/min; detektion: undertrykt ledningsevne; 25 µL injiceret; solutkoncentrationer: 2 µg/L Li+ (1), 19.7 mg/L Na+ (2), 65 µg/L NH4+ (3), 0.9 mg/L K+ (4), 7.2 mg/L Mg++ (5) og 18.5 mg/L Ca++ (6).
Figur 5. Separation af iodid i babymad. – Separationskolonne: IonPac AS11; eluent: 5 mmol/L HNO3; flowhastighed: 1.5 mL/min; detektion: DC amperometri på en Ag-arbejdselektrode; oxidationspotentiale: 0.05 V; prøver: (A) mælkebaseret babymad, (B) sojabaseret babymad.
Figur 6. Separation af polyphosphat i osteprodukter. – Separationskolonner: IonPac AS11 (2-mm); eluent: NaOH koncentrations-gradient; flowhastighed: 0.3 mL/min; detektion: undertrykt ledningsevne; 10 µL injiceret; toppe: (1) PO43-, (2) P2O74-, (3) P3O93-, (4) P3O105-, (5) P4O124- og (6) P4O136-.
