NMR-baseret metabonom-analyse er en ny teknologi i lægemiddelforskning og -udvikling. NMR-spektroskopi kombineret med multivariat dataanalyse (NMR-PR) kan give kvantitativ og kvalitativ information om ændringer i mønstre af endogene metabolitter i biologiske prøver. Det kan udnyttes inden for toksikologi og farmakologi.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 8, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Ulla Grove Sidelmann, Applied Trinomics, Novo Nordisk
Metabonom-analyse betyder, at man kvantitativt studerer et multiparametrisk metabolisk respons i celler og hele organismer på en toksikologisk skade eller en sygdomsproces. NMR-spektroskopi er i denne sammenhæng et vigtigt værktøj, hvormed man kvantitativt og kvalitativt kan måle små molekyler i komplekse blandinger.
Et proton NMR-spektrum af en prøve, der består af en biologisk væske (urin, plasma, serum eller celleekstrakt), kan bruges til at give information, om det mønster af lavmolekylære stoffer prøven indeholder (endogene metabolitter). Denne biokemiske NMR-profil betegnes som prøvens biologiske fingeraftryk. Dette fingeraftryk vil ændre sig karakteristisk som følge af et toksikologisk respons, en sygdomstilstand eller en terapeutisk lægemiddeleffekt. Dvs. ved at få indblik i de kombinationer af metaboliske ændringer der opstår, vil man kunne studere mekanismen bag den givne biologiske proces og responsforløbet.
NMR-spektrene af de biologiske væsker resulterer i komplekse profiler med tusindvis af overlappende signaler (se NMR-spektrum af hhv. rotteplasma og urin i figur 1). Profilerne indeholder en del skjult information. For at finde den relevante information i spektrene kombineres NMR-analysen med multivariat dataanalyse (NMR-PR). Herved reduceres dimensionerne i rummet udspændt af de spektrale variable, og skjulte mønstre i datasættet kan ekstraheres. NMR-PR kan således beskrive, hvad der gør, at prøverne fra to grupper, f.eks. en behandlet og en ikke-behandlet, er forskellige. Herved identificeres en række endogene metabolitter (biomarkører), der er karakteristiske for det fænomen, man studerer. Endelig kan man opstille matematiske modeller, der kan forudsige, om et nyt sæt af uafhængige prøver falder sammen med en af de to (eller flere) beskrevne grupper, såkaldt klassifikation eller etablering af ekspertsystemer. Klassifikation er særlig vigtig, når NMR-PR bruges diagnostisk eller til at forudsige lægemiddeltoksicitet [1-5].
NMR-baseret metabonom-analyse kan således resultere i identifikation af biomarkører, der kan bruges til at beskrive en given sygdomstilstand, effekten af et nyt lægemiddel (in vitro såvel som in vivo), mekanismen bag biokemiske mål for nye lægemidler eller lægemiddeltoksicitet. Metabonom-analyse anvendes parallelt med andre nyere teknologier som »gene-arrays« (transkriptom-analyse) og proteom-analyse. Teknologierne er komplementære. Ved gene array-analyse ser man på regulering på mRNA-niveau, ved proteom-analyse ser man på konsekvenser af denne regulering på protein-niveau, og ved metabonom-analyse ser man på de biokemiske konsekvenser på lavmolekylært niveau. Indgangsvinklen til teknologierne er den samme, idet man i alle tilfælde leder efter ukendte forskelle i en behandlet over for en ikke-behandlet gruppe eller en syg gruppe over for en normal kontrolgruppe.
Teknologiplatform på Novo Nordisk
NMR-spektrene optages ved 600 MHz på et NMR-spektrometer udstyret med en flow probe og et Gilson flow injection system (også kaldet BEST-NMR), hvorved der opnås en vis grad af automatisering af analyserne.
Analysen af de biologiske væsker er simpel, idet der blot tilsættes 10% D2O indeholdende en intern standard. Der er kapacitet til at køre 120 prøver om dagen pr. magnet, og der er på nuværende tidspunkt installeret to 600 MHz NMR-instrumenter. Ud over BEST-NMR er det ene NMR-spektrometer udstyret med mulighed for at køre LC-MS-NMR-eksperimenter. Direkte-koblet LC-MS-NMR bruges, når der skal identificeres ukendte metabolitter.
Proton NMR-spektre analyseres først vha. Bruker AMIX 2.0 software [6]. Herved opnås en primær datakompression, idet hvert NMR-spektrum konverteres til et histogram oftest med 500 til 1000 søjler (figur 2). Hver søjle kan betragtes som en metabolisk deskriptor, der bruges til at klassificere NMR-spektrene i overensstemmelse med de biokemiske kendetegn. Ud fra disse data genereres et statistisk regneark (hver række svarer til et NMR-spektrum, hver kolonne til en metabolisk deskriptor), der bruges som input til en softwarepakke, der kan udføre multivariat dataanalyse (f.eks. SIMCA, Umetrics). Her udføres yderligere datareduktion i form af f.eks. principal komponentanalyse (PCA), der grupperer de NMR-genererede metaboliske data i et flerdimensionalt rum i henhold til f.eks. sygdomstilstand eller effekt versus kontrol. Der genereres to former for diagrammer (figur 2) hhv. et scatter-plot, hvor hvert punkt svarer til et NMR-spektrum, og gruppering studeres, og et loadings-plot der kan tolkes således, at de dele af NMR-spektrene, der er årsag til grupperingen, identificeres. Kun de to første principale komponenter er illustreret her. Den første principale komponent (PC1) svarer til den retning, hvor adskillelsen mellem grupperne er størst. Den anden principale komponent (PC2) er ortogonal på den første og udgør den retning, hvor adskillelsen er næststørst. De metaboliske deskriptorer indeholder de egentlige biomarkørsignaler, og de ansvarlige endogene metabolitter kan identificeres evt. strukturopklares (2D-NMR- eller LC-MS-NMR-procedurer).
Når klassifikation udføres, testes det, om en prøve passer ind i statistisk definerede klasser/grupper. Man kan tale om ekspertsystemer, hvis man har trænet sin model. Det kan f.eks. være til at identificere normalisering af biokemi hos en behandlet gruppe relativt til en korrekt kontrolgruppe, hvilket er tilfældet i forbindelse med effektstudier. Her er det nødvendigt at opbygge en database med NMR-spektre af prøver, som stammer fra studier med modelstoffer og velkarakteriserede sygdomstilstande.
Forudsigelse af toksicitet
I dag produceres der mange potente stoffer i lægemiddelforskningen. Det er ønskeligt, at de stoffer, der sendes videre til udvikling som lægemiddelkandidater, når hele vejen igennem til markedet. Derfor er det vigtigt at vælge de rigtige stoffer, mens der er flere gode kandidater med diverse strukturer at vælge imellem. Potentielle lægemiddelkandidater falder typisk fra i udviklingsfasen pga. uhensigtsmæssige ADMET (absorption, distribution, metabolisme, ekskretion og toksicitet)-egenskaber [7]. Valget af de bedst egnede lægemiddelkandidater kræver, at man har de rette redskaber til rådighed til at teste for disse egenskaber. Hensigtsmæssig screening skal foregå så tidligt som muligt under devisen: »Falder stofferne tidligt, falder de billigt«. Mens der inden for ADME længe har været tilgængelige high throughput-screeningsmetoder er det anderledes inden for screening for stoffers potentielle toksicitet. Vha. NMR-PR kan man lave et screeningsværktøj, der kan frasortere potentielt toksiske stoffer, inden de sendes til udvikling.
Etablering af database med modeltoksiner
Det er her vigtigt at have en stor database af kendte toksiner at teste sine stoffer op imod. I samarbejde med andre internationale medicinalvirksomheder etableres i øjeblikket en database, der består af NMR-spektre af urinprøver fra rotter doseret med over 200 forskellige modeltoksiner. Det er målet at lave et ekspertsystem, der kan forudsige om nye stoffer er potentielt toksiske.
For hvert doseret stof er der givet to forskellige doser, og rotterne er fulgt fra før de blev doseret op til 168 timer efter. Det giver mulighed for at studere dosisafhængighed og forløbet af det toksiske respons. Et af de undersøgte modeltoksiner er hydrazin, og en PCA-analyse af NMR-spektrene fra prøverne i dette studie er vist i figur 3. I gruppen doseret med højeste dosis blev der observeret et irreversibelt toksisk respons, hvorimod dyrene i den laveste dosisgruppe blev normaliseret efter 24 timer. De biomarkører, der blev identificeret ved forsøget (figur 4), reflekterede den toksiske mekanisme af stoffet [8,9]. Hydrazin giver fedt-akkumulering i leveren, hvorved der udskilles 2-aminoadipinsyre i urinen. Desuden ses øgede niveauer af taurin og kreatin i urinen på det højeste dosisniveau som følge af celledød i leveren.
Karakterisering af dyremodeller og identifikation af biomarkører for en given terapeutisk effekt
Mange sygdomstilstande er dårligt beskrevet mht. til biokemiske mekanismer, og det resulterer ofte i utilstrækkelige biomarkører. Sygdomstilstande er oftest et resultat af en række komplekse forløb, hvorfor disse optimalt evalueres ud fra et multivariat i forhold til et univariat udgangspunkt. NMR-PR kan bruges til at øge forståelsen for de biokemiske mekanismer, der foregår i komplekse metaboliske sygdomme som f.eks. Type II diabetes. Der kan genereres biomarkører for de forskellige sygdomsprocesser, og brugen af disse markører kan evalueres til test af nye lægemidlers terapeutiske potentiale. Type II diabetes er oftest relateret til for høje sukker- og lipidniveauer i blodet, og det er vigtigt at kunne designe lægemidler, der både har sukker- og lipidsænkende egenskaber. Det kræver, at der er etableret analytiske metoder til at karakterisere de tilgængelige dyremodeller mht. de rette biokemiske parametre. Derudover er sygdomstilstanden i mange af de dyremodeller, der bruges i forskningen, genetisk modificeret, genetisk selekteret eller fødeinduceret, og det kan være svært at forudsige det rette tidspunkt at anvende dyrene på og at sammensætte homogene populationer af dyrene. Ved at følge den NMR-genererede metaboliske profil i plasma- eller urinprøver fra dyrene, kan man følge deres sygdomstilstand, udpege dyr der ikke tilhører deres gruppe (outliers) og samtidig identificere biomarkører for den givne tilstand.
NMR-PR-analyse er brugt til at karakterisere ZDF- og Zucker-rotter, hvor de fede dyr er de syge dyr, og de tynde dyr bruges som deres kontrolgruppe. Dyrene har samme genetiske defekt, og begge dyremodeller udvikler forhøjede lipidniveauer i plasma (dyslipidæmi), men kun ZDF-rotten udvikler Type II diabetes. Vi fulgte dyrene vha. NMR-analyse af både urin og plasma fra de var 6 til 12 uger gamle. Ved at studere PCA-modellerne fra NMR-spektrene af urinprøverne var det tydeligt, at kun ZDF-rotterne blev diabetiske (udskillelse af øgede niveauer af glukose, ketonstoffer og aminosyrer), samt at de først efter 12 uger alle var blevet diabetiske. Både de fede Zucker-rotter og ZDF-rotterne havde øgede proteinniveauer og øgede niveauer af forskellige osmolytter i urinen ved 12 uger, som tegn på at deres nyrer er belastet af sygdomstilstanden. I figur 2 er PCA-modellen af NMR-spektrene fra de urinprøver, der blev opsamlet, da dyrene var 12 uger gamle, præsenteret. Som det ses grupperede ZDF-dyrene sig i en diskret homogen gruppe i forhold til kontroldyrene og Zucker-rotterne. I plasma forholder det sig anderledes (figur 5). PCA-modellen på NMR-spektrene fra plasma viser, at de fede dyr og kontroldyrene grupperer sig separat langs den første principale komponent (metaboliske deskriptorer: lipoproteiner, glycoprotein, andre lipider og laktat). ZDF- og Zucker-rotterne adskiller sig langs den anden principale komponent (metaboliske deskriptorer: glukose og VLDL [very low density lipoproteins]). Det ses tydeligt, hvor let outliers kan identificeres. Når NMR-PR anvendes i lægemiddeleffekt-studier, testes det, om de behandlede fede dyr normaliseres, dvs. grupperer sig sammen med kontroldyrene. Da vi ønsker at evaluere effekter på både sukker- og lipidparametre, anvendes der primært plasmaanalyser.
Fremtidsaspekter – integration af data med andre genomics-teknologier
Screening for effekt og bivirkninger i forbindelse med kliniske forsøg (forsøg i raske frivillige og patienter) er særlig kritisk i forbindelse med evalueringen af potentielle lægemidler, når de skal igennem de sene og dyre trin af udviklingsfasen. Derfor kan udviklingen af nye og mere effektive værktøjer til dette formål få stor økonomisk betydning i det lange løb. Måling af klinisk effekt af potentielle lægemidler giver pga. mangel på gode markører til at vurdere effekten med ofte teoretiske og praktiske problemer. Det skyldes, at den sygdomstilstand, man ønsker at kurere, er dårligt karakteriseret ud fra et metabolisk synspunkt som beskrevet ovenfor. Det er derfor ønskeligt, at de biomarkører, der identificeres vha. NMR-PR i dyr i de prækliniske faser, valideres mht. evnen til tidligt at kunne anvendes i screening af potentielle lægemidler for fordelagtige biokemiske og fysiologiske effekter samt for uhensigtsmæssige bivirkninger. Senere vil det være værdifuldt at medtage disse markører ved vurdering af lægemidlets evne til at helbrede i de kliniske forsøg. Det er af stor betydning, hvis mønstrene af endogene metabolitter identificeret i plasma eller urin kan korreleres til genetiske markører identificeret i vævene vha. gene-array-teknologi. Det vil give større forståelse for de mekanismer, der styrer effekten af det aktuelle lægemiddel, og man vil fra en plasmaprøve kunne etablere et indirekte mål for regulering af generne i væv.
Integration af data fra hhv. »gene-array«-, proteom- og metabonom-analyse vil i det hele taget blive af stor betydning for forståelsen af den måde, nye lægemidler virker på, for forståelsen af de sygdomstilstande vi ønsker at kurere, samt for identifikation og karakterisering af de metaboliske mål vi ønsker at angribe, når vi designer nye lægemiddelmolekyler. Det udgør samtidig en af de store udfordringer i lægemiddelforskning og -udvikling i dag, nemlig hvordan vi håndterer alle de data, vi genererer, og hvordan vi får trukket den relevante information ud af alle disse data.
Referencer
1. Holmes, E., Caddick, S., Lindon, J.C. Beddell, C., Wilson, I., Kryvawych, S., and Nicholson, J.K. (1995) 1H and 2H NMR spectroscopic studies on the metabolism and biochemical effects of 2-bromoethaneamine in the rat. Biochemical Pharmacology 10 1349-1359.
2. Messana, I., Forni, F., Ferrari, F., Rossi, C., Giardina, B. and Zuppi, C. (1998) Proton nuclear magnetic resonance spectral profiles of urine in type II diabetic patients, Automation and Analytical techniques 44 1529-1534.
3. Nicholson, J.K., Lindon, J.C. and Holmes, E. (1999) »Metabonomics«: Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statisticat analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica 29 1181-1189.
4. Holmes, E. Bonner, F. Sweatman, B.C. Lindon, J. Beddell, C. Rahr, E. and Nicholson, J.K. (1992) NMR spectroscopy and pattern recognition analysis of the biochemical processes associated with the progression and recovery from nephrotoxic lesions in the rat induced by mercury II chloride and 2-bromoethanamine. Molecular Pharmacology 42 922-930.
5. Holmes, E. Foxall, P.J.D. Neild, G.H. Beddell, C. Sweatman, B.C. Rahr, E. Lindon, J.C. Spraul, M. and Nicholson, J.K. (1994) Automatic data reduction and pattern recognition methods for analysis of 1H nuclear magnetic resonance spectra of human urine form normal and pathological states. Analytical Biochemistry 220 284-296.
6. Spraul, M. Neidig, P. Klauck, U. Kessler, P. Holmes, E. Nicholson, J.K. Sweatman, B.C. Salman, S.R. Rahr, E. Beddell, C. and Lindon, J.C. (1994) Automatic reduction of NMR spectroscopic data for statistical and pattern recognition classification of samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 12 (10) 1215-1227.
7. Kennedy, T, (1997) Managing the drug discovery/development interface, Drug Discovery Today 2, 436-444.
8. Waterfield, C.J., Delaney, J., Kerai, M.D. and Timbrell, J.A. (1997) Correlations between in vivo and in vitro effects of toxic compounds, studies with Hydrazine, Toxicology in vitro 11, 217-227.
9. Waterfield, C.J., Asker, D.S. and Timbrell, J.A. (1997) Triglyceride accunulation in isolated hepatocytesafter treatment with hydrazine, Chemico-Biological Interactions 107, 157-172.
Trinomics: post-genomiske komplementære teknologier
1. Genomics
Mikro-array-analyse (Gene Chips)
Undersøgelser af regulering på mRNA-niveau
2. Proteomics
2D-gelelektroforese kombineret med MS-analyse (sekventering)
Undersøgelse af ændringer af udtrykte proteiner, inklusiv post-translationelle modifikationer
3. Metabonomics
NMR- eller MS-analyse af små molekyler
Undersøgelse af ændringer i små molekyler (endogene metabolitter) som en konsekvens af ændringer observeret i 1 og 2.
Figur 1. 600 MHz 1D 1H NMR-spektrum: Øverst af rotteplasma, nederst af rotteurin. Plasmaprøven er pga. sit indhold af mange lipider domineret af brede signaler, hvorimod urinprøven pga. sit indhold af mange små polære molekyler er domineret af mange skarpe signaler.
Figur 2. Illustration af databehandling i forbindelse med NMR-PR-analyse. Øverst 600 MHz 1H NMR-spektrum der komprimeres vha. Bruker AMIX 2.0 software til et histogram. Ud fra histogrammet genereres et statistisk regneark, hvorefter der udføres multivariat dataanalyse (her PCA). Resultatet er et scatter-plot, hvor hvert punkt svarer til et NMR-spektrum og et loading-plot med de metaboliske deskriptorer, der beskriver adskillelsen. PCA-modellen stammer fra NMR-spektrene af urinprøverne opsamlet fra ZDF- og Zucker-rotter, da dyrene var 12 uger gamle. De lilla punkter er ZDF-rotterne, og de blå er deres kontrolgruppe. De røde er Zucker-rotterne, og de lyseblå er deres kontrolgruppe. PC1 og PC2 angiver retningen af henholdsvis den første og den anden principale komponent.
Figur 3. PCA-model (scatter-plot til venstre og loading-plot til højre) af NMR-spektre af urin opsamlet fra rotter doseret med en enkelt dosis hydrazin hhv. en høj og en lav dosis. Urin er opsamlet over 8 timer på 7 forskellige tidspunkter. Den røde gruppe i modellen er vehikel-dyr (kontrolgruppen), den blå gruppe modtog lav dosis af hydrazin, og den lilla gruppe modtog høj dosis hydrazin. Ved hvert punkt er det angivet, hvornår prøven er opsamlet. I loading-plottet kan man se, hvilke metabolitter der er ansvarlige for adskillelsen af de behandlede dyr fra kontroldyrene.
Figur 4. Udvalgte 600 MHz 1D 1H NMR-spektre af urinprøver fra hydrazinbehandlede rotter i den højeste dosisgruppe. Nederst vises spektret af en urinprøve opsamlet før dosering, i midten spektret 24 timer efter dosering og øverst 48 timer efter dosering. De identificerede metabolitter, der har betydning for adskillelsen af grupperne i figur 3, fremgår af spektrene.
Figur 5. PCA-model (scatter-plot) af NMR-spektre af plasma opsamlet fra ZDF- og Zucker-rotter samt deres tynde kontrolgrupper. Inddeling i grupper fremgår tydeligt af figuren, og de dyr, der falder uden for deres gruppe, er illustreret som »outliers«.
