Fisk er i stigende grad blevet husdyr, der opdrættes i dambrug. Sygdomme hos fisk kan forebygges ved at tilsætte probiotiske bakteriekulturer, men probiotika skal udvælges, så de passer til både fisk og patogen.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 11, 2003 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Lone Gram, Afdeling for Fiskeindustriel Forskning, Danmarks Fiskeriundersøgelser
Fisk er blevet husdyr, der opdrættes og holdes i fersk- eller havvandsanlæg. I dag kommer ca. 1/3 af de fisk, vi spiser fra opdræt. Fiskeopdrætssektoren er i vækst, især i Sydøstasien, og samtidig er mængden af fisk fanget fra vilde bestande stagneret de sidste 10 år.
Fisk kan i lighed med alle andre organismer blive syge og rammes af bakterie-, virus- og parasitinfektioner. Som hos andre husdyr og dyrkede planter giver det store problemer, og fiskeopdrættere kæmper på samme måde som landmænd og gartnere for at kontrollere de mange forskellige sygdomme.
Bakteriesygdomme har været bekæmpet med antibiotika, men er i stigende grad bragt under kontrol vha. vaccinationsprogrammer. Man er i alle led af kæden fra »hav-til-mav« interesseret i at nedbringe brugen af antibiotika.
Antibiotika, der bruges i opdræt og husdyrbrug, kan spredes i miljøet. Derved kan nogle af de bakterier, der findes på fisken og i vandet, blive resistente over for antibiotika. Efterfølgende kan antibiotikaresistens overføres til andre bakterier. Hvis fisken efterfølgende bliver inficeret med en resistent bakterie, kan sygdommen ikke behandles, hvilket har betydelige økonomiske konsekvenser for dambrugsejeren.
Antibiotikaresistens kan få meget alvorlige konsekvenser, hvis den overføres til bakterier, der kan forårsage sygdom hos mennesker. Det kan betyde, at et normalt ukompliceret sygdomsforløb hos mennesker pludselig ikke kan behandles.
Kan fiskens naturlige mikroflora bruges?
Fisken er et koldblodet dyr, der gennemgår mange udviklingstrin: Fra æg til små larver, der fodres med levende foder (små hjuldyr og skaldyr), til yngel og endelig til voksne fisk. Fiskens immunsystem er i de tidlige stadier meget dårligt udviklet. Vaccination kræver, at et immunforsvar kan stimuleres og »huske« til senere forsvar. Det er derfor svært at vaccinere larver og meget små fisk, og især i disse stadier interesserer man sig derfor for andre sygdomsforebyggende strategier.
Alle organismer, mennesker, dyr, planter – og fisk – har en naturlig mikroflora. Disse bakterier og andre mikroorganismer findes på hud, skind og i tarmsystemet og lever med os i »fredelig sameksistens«. Inden for mange områder har man længe haft den teori, at en del af disse mikroorganismer er til gavn – at de hjælper med at holde sygdomsfremkaldende mikroorganismer væk.
Inden for plantesektoren, dyrehold og til menneskebrug har man i adskillige år eksperimenteret med bakteriekulturer, der skulle gavne helbredstilstanden og forebygge sygdom. Sådanne levende bakteriekulturer, der forventes at øge modstandsdygtigheden mod sygdom, kaldes probiotika [1].
Ved Danmarks Fiskeriundersøgelser har vi i en årrække arbejdet på projekter, hvor det vurderes, om sygdomme hos fisk kan forebygges ved at tilsætte levende ikke-sygdomsfremkaldende bakteriekulturer til vandet. Vi vælger de formodentlig gavnlige bakterier fra fiskens egen mikroflora, og nogle af disse har i laboratorieforsøg vist sig at kunne hæmme vækst af de bakterier, der forårsager sygdom hos fisk. Ved at forebygge sygdom kan brugen af antibiotika til sygdomsbekæmpelse mindskes og risikoen for udvikling af antibiotikaresistens reduceres.
Probiotika til fisk?
Levende kulturer af mikroorganismer, der kan gavne helbredet hos værten, kaldes for probiotiske (pro = for; bios = liv) kulturer. Til varmblodede dyr og mennesker har man typisk brugt mælkesyrebakterier, der indtages med kosten for at stabilisere tarmfloraen. I begyndelsen af 1900-tallet observerede den russisk fødte professor Ilja Iljitsh Mechnikov ( http://www.nobel.se/medicine/laureates/1908/mechnikov-bio.html ), at nogle befolkningsgrupper i Bulgarien levede væsentlig længere end andre. Hans undersøgelser ledte til den konklusion, at det var indtagelsen af kefir – og med den levende kulturer af mælkesyrebakterier – der var årsag til den forbedrede sundhedstilstand.
Hos fisk er det ikke kun tarmkanalen, der er vigtig for inficerende – og gavnlige – bakterier. Fisken svømmer i vand, der meget nemt kan overføre bakterier, og dens skindside og gæller er konstant eksponeret for de mikroorganismer, der er i vandet. Derfor kan det være lige så vigtig at beskytte skindsiden hos fisk som tarmkanalen. Der er således flere eksempler på, at probiotika i akvakultur har virket ved, at de gavnlige bakteriekulturer bliver tilsat det vand, fisken svømmer i.
Hvordan vælges fiskeprobiotika?
Man ved ikke præcis hvilke egenskaber, der er vigtige, for at en bakterie kan virke som probiotika. Den må naturligvis ikke kunne forårsage sygdom hos hverken fisk eller mennesker. Men, er det f.eks. vigtigt, at den kan sætte sig fast på fiskeceller – eller er det nok, at den svømmer rundt i vandet? Hvis den skal virke i tarmsystemet, er det formodentlig vigtigt, at den kan overleve galdesalte og mavens lave pH-værdi. Det er muligvis vigtigt at vælge en bakterie, der »passer til« sit virkningssted – altså enten adapteret til skind, gæller eller tarmsystem [2,3].
Da probiotiske bakteriekulturer skal bekæmpe patogene bakterier, har man, meget naturligt, ledt efter bakterier, der kan hæmme væksten af patogene bakterier. Bakterierne undersøges indledningsvis i petriskåle, hvor den patogene bakterie støbes ind i en næringsrig agar, og den potentielle probiotiske bakterie placeres i afmærkede områder. Efter inkubering kan opklaringszoner vise, om den patogene bakterie er blevet hæmmet (figur 1). Normalt finder man, at kun 1-4% af de bakterier, der er isolerede fra f.eks. fisk, kan hæmme fiskepatogene bakterier [4,5]. Det kan derfor være meget tidskrævende at finde og udvælge de rigtige bakterier. Selv om 1-4% ikke lyder af meget, kan det dreje sig om millioner af bakterier – og det kan være rigeligt til at holde de sygdomsfremkaldende bakterier i skak. Vi har for nylig undersøgt prøver fra en pighvaropdrætter i Spanien – her har vi sået prøver ud på næringsagar, og efter bakteriernes fremvækst har vi vha. af et filterpapir overført et aftryk af bakterierne til en ny agarplade med fiskepatogene bakterier. Efter endnu en inkubering kan vi – uden at behøve at isolere alle bakterierne – se hvilke, der hæmmer de fiskepatogene bakterier. Vi kan nu målrettet isolere dem, der har potentiale (figur 2).
Virker det?
Vi har i samarbejde med BioMar A/S udført forsøg [5,6], hvor ørreder under kontrollerede betingelser inficeres med bakterien Vibrio anguillarum, der giver sygdommen vibriose (figur 3). Efterfølgende behandles nogle af fiskene med probiotiske bakterier; i dette tilfælde Pseudomonas-bakterier, der flere gange dagligt tilsættes tank-vandet. I figur 4 ses et infektionsforløb, hvor 5 bakteriestammer er blevet testet i model-infektionssystemet. Det viste sig, at de fleste af de tilsatte »gavnlige« bakterier forbedrer overlevelsen, og at især 2 bakteriestammer var meget virksomme. Af hensyn til dyrevelfærden er det naturligvis vigtigt at begrænse disse forsøg mest muligt – omvendt er de nødvendige i enhver afprøvning af sygdomsforebyggende foranstaltninger.
Hvordan virker det?
De Pseudomonas-bakterier, der i ørredforsøg har været sygdomsreducerende, danner nogle stoffer, såkaldte siderophorer, der kelerer jern. Jern er central for bakterier (og mange andre), men er sjældent let tilgængeligt. Fe (III) er oxiderende og er i høj koncentration ødelæggende for levende væv. Derfor findes jern i komplekse forbindelser, og bakterier har udviklet en højt specialiseret strategi for at få fat på det nødvendige næringsstof. Én af pseudomonaernes siderophorer ses i figur 5 [8]. Vi har også vist [9], at Vibrio anguillarum udtrykker gener, der induceres af jern-sult, når den udsættes for den probiotiske bakterie.
Andre probiotiske bakterier virker på andre måder. F.eks. arbejder vi i øjeblikket med en marin, fototrof bakterie: Roseobacter, der er isoleret fra pighvaropdræt [4]. Denne bakterie danner et extracellulært stof, der dræber fiskelarve-patogene bakterier. Stoffet er lavmolekylært og kan ikke ekstraheres i ethylacetat eller chloroform – men vi ved endnu ikke, hvad det er. Sådan viden er meget vigtig i forbindelse med brugen af probiotiske bakterier – de skulle nødig bare være små antibiotikaproducerende enheder – det vil ikke løse problemerne med antibiotikaresistens.
Praktisk anvendelse af probiotika i akvakultur
Fiskeprobiotika undersøges mange steder i verden, og forskningsgrupper i Norge, Frankrig, Skotland, Australien og Danmark forsøger at udvikle princippet [10]. Praktisk anvendelse af probiotika finder i dag bl.a. sted i rejeindustrien i Sydøstasien, hvor filippinske opdræt har været ramt af resistente sygdomsfremkaldende bakterier. Det har medført økonomisk krise og kollaps af produktionen i flere områder, men tilsætning af probiotiske Bacillus-kulturer til vandet har vist sig effektivt at kunne forebygge bakteriesygdom.
Dvs. princippet fungerer »i det virkelige liv«. Men, det bliver ikke den magiske »golden bullet«, der løser alle problemer. Probiotika til fisk skal udvælges, så det passer til både fisk og patogen.
Forfatteren vil gerne takke en lang række medarbejdere og kolleger for samarbejde. Det drejer sig om Bettina Spanggaard, Jette Melchiorsen, Janne Nielsen og Mette Hjelm (nuværende og tidligere ansatte) ved DFU; Ingrid Huber, Kim Holmstrøm og Lone Rossen fra Bioteknologisk Institut; Torben Nielsen og Helma Slierendrecht fra BioMar A/S; Uffe Anthoni, Per H. Nielsen og Carsten Christophersen fra Kemisk Lab II, KU samt Ana Riaza fra Stolt SeaFarms i Santiago, Spanien.
Referencer:
1. FAO/WHO 2001. Evaluation of health and nutritional properties of powder milk and live lactic acid bacteria. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization expert consultation report. FAO, Rome, Italy.
2. Spanggaard B., Huber I., Nielsen J., Nielsen T., Appel K.F. and Gram, L. (1999) The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification. Aquaculture 182:1-15.
3. Huber, I., B. Spanggaard, J. Nielsen, K.F. Appel, T.F. Nielsen and L. Gram 2003. Phylogenetic analysis and in situ identification of the intestinal microbial community of rainbow trout (Onchorhynchus mykiss, Walbaum). Journal of Applied Microbiology (accepted)
4. Hjelm, M., Ø. Bergh, J. Nielsen, J. Melchiorsen, S. Jensen, H. Duncan, A. Riaza, P. Ahrens, H. Birkbeck and L. Gram 2003. Selection and identification of autochthonous potential probiotic bacteria from turbot larvae (Scophtalmus maximus) rearing units. Systematic and Applied Microbiology (accepted)
5. Spanggaard, B., I. Huber, J. Nielsen, E.B. Sick, C. B. Pipper, T. Martinussen, W.J. Slierendrecht and L. Gram 2001. The probiotic potential against vibriosis of the indigenous microflora of rainbow trout. Environmental Microbiology 3:755-765
6. Gram L., Melchiorsen J., Spanggaard B., Huber I. and Nielsen T. (1999) Inhibition of Vibrio anguillarum by a siderophore producing Pseudomonas fluorescens – a possible probiotic treatment of fish. Applied and Environmental Microbiology 65:969-973.
7. Spanggard, B. og L. Gram 2001. Fiskeprobiotika. Fisk og Hav 52:44-48
8. Anthoni, U., C. Christophersen, P.H. Nielsen, L. Gram and B.O. Petersen 1995. Pseudomonine, an isoxazole with siderophoric activity from Pseudomonas fluorescens, AH2 isolated from Lake Victorian Nile perch. Journal of Natural Products 58:1786-1789
9. Holmstrøm, K. and L. Gram 2003. Elucidation of the Vibrio anguillarum genetic response to Pseudomonas fluroescens AH2-supernatant exposure using RNA-arbitrarily primed PCR. Journal of Bacteriology 185:831-842.
10. Gram, L. and E. Ringø 2003. Prospects of fish probiotics. In: Holzapfel, W. and P. Naughton (eds) Microbial ecology of the growing animal. Elsevier. (in press)
