Her beskrives en nyudviklet metode til at forudsige spiring og vækst af mikroorganismer under naturlige forhold. Metoden er afprøvet inden for jordbundsmikrobiologi, og den kan uden større modifikationer bruges inden for andre faglige discipliner såsom levnedsmiddelmikrobiologi.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2001 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Charlotte Thrane og Jens Wolstrup, KVL
Det er almindelig udbredt at undersøge effekten af simple eller komplekse miljøbetingelser på mikroorganismers vækst ved dyrkning på petriskåle i laboratoriet. Men resultaterne vil ofte være mangelfulde eller misvisende i forhold til, hvordan mikroorganismerne reagerer i naturlige miljøer som eksempelvis jord. Her beskrives en metode, hvor man direkte undersøger effekten af det naturlige miljø på mikroorganismernes vækst. Kun i det naturlige miljø findes der konkurrence fra andre mikroorganismer, endvidere kan substratet som oftest ikke reproduceres i almindelige laboratorieforsøg. I nogle sammenhænge er det væsentligt at kende effekten af miljøet på et tidligt tidspunkt i mikroorganismernes vækstfase – dvs. før der er dannet makroskopiske kolonier. Højberg et al. (1997) har udviklet en metode til anaerob dyrkning af bakterier, som vi siden har modificeret til at kunne belyse forskellige problemstillinger inden for jordbundsmikrobiologi. Med denne metode er det muligt at:
1. undersøge spiring og vækst af mikroorganismer i det naturlige miljø, som organismerne findes i eller introduceres til
2. undersøge meget tidlig spiring og vækst af mikroorganismer (f.eks. sporespiring).
Metoden
Princippet i metoden er udviklet af Højberg et al. (1997). I vores forsøg er metoden modificeret til de valgte problemstillinger (figur 1). For at kunne studere sporespiring og mikrokolonidannelse på enkeltcelleniveau immobiliseres sporerne i et siliconelag. De immobiliserede bakterier kan let håndteres, da de monteres på et dækglas. Denne »sandwich« kan derpå placeres i det miljø, hvor man ønsker at se effekten af bakteriernes spiring og vækst. Opstillingen til forsøget er beskrevet i »Eksempel 1« og vist i figur 1. For at muliggøre mikroskopi af cellerne indfarves bakterierne slutteligt med et fluorescensfarvestof.
Eksempel 1: Direkte mikroskopi af Bacillus endosporespiring i jord
Det er almindeligt udbredt at bejdse frø med fungicider. Formålet er at forhindre patogene svampe fra jorden i at angribe spirende frø og unge kimplanter. For at nedsætte brugen af kemikalier i jordbruget har man gennem lang tid søgt efter alternative metoder til at beskytte planter med – herunder brug af biologiske bekæmpelsesmidler.
I et forskningsprojekt på Institut for Økologi, KVL søges der efter bakterier, der forekommer naturligt i danske sukkerroemarker og har en hæmmende effekt over for plantepatogene svampe. Inden for biologisk bekæmpelse af de spiringsskadende svampe af slægterne Pythium og Rhizoctonia har adskillige Bacillus-stammer vist en god effekt.
Bacillus spp. er en gruppe af bakterier, der er uønskede eller ønskede alt afhængig af, om det er patogene eller gavnlige stammer. Metoden er i det viste eksempel anvendt til studier i jord for at undersøge spiring og mikrokolonidannelse af en svampehæmmende Bacillus spp.
Denne bakteriegruppe danner sporer, der har en god overlevelse under ugunstige forhold. Sporernes tørkeresistens og dermed langtidsholdbarhed på frø gør brug af Bacillus spp. til frøbejdsning til et realistisk alternativ til kemisk frøbejdsning. Derimod er det langt vanskeligere teknologisk at anvende ikke-sporedannende bakterier som Pseudomonas spp., da man endnu ikke har gode metoder til at bejdse disse bakterier på frø på en måde, så deres overlevelse sikres. Imidlertid er sporespiringen af Bacillus spp under naturlige forhold oftest lav og for langsom til, at bakterien kan nå at beskytte et spirende frø mod hurtigt voksende spiringsskadende svampe. Det gør det til et problem at anvende Bacillus spp. kommercielt.
Det blev derfor undersøgt om endosporespiring kunne stimuleres ved tilsætning af næringsstof. Blandt de undersøgte billige og komplekse næringsstoffer viste skummetmælk sig at give en god stimulering af spiring og mikrokolonidannelse af bakterierne (figur 2). Det vil i fremtidige forsøg blive undersøgt, hvorvidt bejdsning af frø med de svampehæmmende bakterier og skummetmælk vil reducere angreb af patogene svampe i sukkerroedyrkning.
Eksempel 2: Sporespiring af den nematodfangende svamp Duddingtonia flagrans i kokasser
Indvoldsorm er et stort problem hos ungt kvæg. Sygdommen skyldes nematoden Ostertagia ostertagi. Nematoden inficerer dyrene, når de æder græs, der har vokset i nærheden af en kokasse, hvori de sygdomsfremskaldende nematoder er til stede (nematoderne findes i faeces fra syge dyr). Svampen Duddingtonia flagrans danner fangstnet, der fanger nematoderne, hvorefter svampen dræber organismen. Sporerne fra D. flagrans tilføres dyrene via foderet. Men det er først i kokassen, svampen har mulighed for at parasitere nematoderne og dermed reducere risikoen for smittespredning. Det er imidlertid essentielt, at svampesporerne spirer hurtigt frem i kokassen for at kunne dræbe nematoderne. Faktorer, der påvirker væksten af svampen, kan foruden substratet være pH og iltforhold.
Svampesporer af D. flagrans blev immobiliseret i et system (som vist i figur 1), der blev placeret i en kokasse. Efter 7 døgn blev prøverne taget ud af kokassen og mikroskoperet (Klaus Skaalum Lassen, 1999). Det ses af figuren, at svampesporerne er spiret, og der er dannet fangstnet (figur 3). Ligesom i det foregående eksempel ville det ikke have været muligt at reproducere konkurrence og substrat på tilfredsstillende måde under laboratorieforhold.
Metodens perspektiver
I de viste eksempler er metoden brugt til at anskueliggøre effekten på spiring og vækst på to forskellige mikroorganismer i naturlige miljøer. Ved at se direkte på miljøeffekter slipper man for at skulle vurdere, om resultater opnået under laboratorieforhold med rimelig sikkerhed kan overføres til det naturlige miljø.
Det er oplagt, at metoden kan anvendes inden for andre fagområder end jordbundsmikrobiologi.
Inden for levnedsmiddelmikrobiologi kan metoden bruges til studier af miljømæssige faktorers effekt på spiring af patogene Bacillus spp. sporer. En anden problemstilling inden for dette fagområde kan være i undersøgelser af brug af sporedannede baciller som konservering af levnedsmidler.
Litteratur
O. Højberg, S. J. Binnerup, J. Sørensen. 1997. Growth of silicone-immobilized bacteria on polycarbonate membrane filters, a technique to study microcolony formation under anaerobic conditions. Applied and Environmental Microbiology 63: 2920-2924.
K. Skaalum Lassen. 1996. Undersøgelser af Duddungtonia flagrans´ vækstbetingelser i kvæggødning. Herunder afprøvning af nyt vækstkammer. Bacheloropgave ved Institut for Økologi, KVL.
C. Thrane, S. Olsson, J. Wolstrup, J. Sørensen. 2000. Note: Direct microscopy of Bacillus endospore germination in soil microcosms. Journal of Applied Microbiology 89: 595-598.
Projektet er finansieret af Fødevareministeriets Strukturdirektorat og har Sektion for Genetik og Mikrobiologi på Novo Nordisk og Danisco Seed A/S som industrielle samarbejdspartnere. På KVL er professor Jan Sørensen, lektor Stefan Olsson, lektor Jens Wolstrup, forskningslektor Tommy Harder Nielsen, forskningslektor Charlotte Thrane, forskningsadjunkt Mette Neiendam Nielsen samt laborant Dorte Rasmussen tilknyttet projektet.
Figur 1. Forsøgsopstilling til undersøgelse af endosporespiring i jord. Bakterier filtreres ned på en polycarbonatmembran, som placeres ovenpå et dækglas med et tyndt lag silicone. Når bakterierne placeres i siliconen forbliver de immobile, og spiring af enkelte sporer eller mikrokolonidannelse fra enkelte sporer kan derfor ses ved mikroskopi (figur 2). I det viste eksempel er »sandwichen« med de immobiliserede sporer placeret i et jordmikrokosmos. I dette forsøg var det hensigten at simulere et frø bejdset med antagonistiske baciller sammen med et spiringsstimulerende næringsstof. Således er der mellem jorden og de immobiliserede baciller placeret et glasfiberfilter med skummetmælk. Når forsøget gøres op, farves bakterierne med acridinorange og mikroskoperes.
Figur 2. Direkte mikroskopi af endosporespiring og mikrokolonidannelse af den svampehæmmende Paenibacillus polymyxa CM5-5. (A) Spiring af bakterien under sterile forhold på agar viser en tæt mikrokolonistruktur. (B) En mikrokoloni af bakterien ses her i jordmikrokosmos med tilsætning af skummetmælk. Celletætheden i denne mikrokoloni er mindre end under sterile forhold. Bar=30 mm.
Figur 3. Direkte mikroskopi af spiring og vækst af den nematodfangende svamp Duddingtonia flagrans efter inkubering i en kokasse. Det ses af figuren, at svampen er spiret, og der er dannet fangstnet (Foto: Klaus Skaalum Lassen).
