Røntgenpulverdiffraktion kan bruges som analyseværktøj til at bestemme fedtstoffers krystalformer. Strukturen af fedtstofferne er vigtig for kvaliteten af et fødevareprodukt.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 9, 2006. Teksten kan desuden læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Nina Lock,a Markus Klinger,a Jesper Munk Jakobsen,b Bjarne Juul,b Finn Krebs Larsen,a Bo Brummerstedt Iversena Kemisk Institut, Aarhus Universitet, bAarhusKarlshamn
God chokolade skal smage godt og have den rigtige konsistens, så den smelter i munden og frister med sin glatte overflade. Chokoladens tekstur og smeltepunkt afhænger af fedtstoffernes krystalstruktur. Fedtstofferne kan antage forskellige strukturer, hvoraf især én er uønsket i fødevarer. Det er velkendt, at chokolade, der på en varm dag er smeltet og efterfølgende størknet, ofte får en kedelig grålig overflade. Det skyldes en ændring i fedtstoffets krystalform.
Chokoladeprodukter må indeholde op til 5% vegetabilsk fedtstof (der ikke er udvundet af kakaobønnen) og stadig kaldes chokolade. Et produkt, der indeholder mere end 5%, betegnes vekao. Nogle vegetabilske fedtstoffer kan påvirke chokoladens fysiske egenskaber i gunstig retning og samtidig være konkurrencedygtige på prisen. For fedtstofproducenterne er det derfor essentielt at kende fedtstoffers krystalformer. De kan undersøges vha. røntgenpulverdiffraktion og termisk analyse.
I det følgende beskrives resultater fra et 3. års studenterprojekt på Kemisk Institut, Aarhus Universitet, udført i samarbejde med AarhusKarlshamn (det tidligere Aarhus United A/S), der bl.a. producerer specialfedtstoffer til chokolade og konfekture.
Triglycerider
Langt størstedelen af de fedtstoffer, der indgår i vores fødevarer, er triglycerider, der er estere af glycerol og tre fedtsyrer. Fedtsyrerne er uforgrenede carboxylsyrer med et lige antal carbonatomer op til 24. Ofte er to eller alle tre carboxylsyrer i et triglycerid forskellige. Fedtsyrerne inddeles i mættede, monoumættede og polyumættede afhængigt af antallet af dobbeltbindinger i carbonkæden. Naturlige umættede fedtsyrer forekommer hovedsageligt i cis-konformationen. Triglycerider er i sig selv farveløse og uden smag, og anvendelsesmulighederne af forskellige olier er afhængige af den kemiske sammensætning, der igen afhænger af råvarerne, olierne er udvundet af. De fleste råvarer, der oparbejdes i den danske olieindustri er af tropisk oprindelse og omfatter bl.a. kokosnødder, palmekerner, sheanødder, jordnødder og sojabønner. Af danske råstoffer er det kun raps- og fiskeolie samt svine- og oksefedt, der anvendes i betydelige mængder. Olierne anvendes primært som spiseolier og i margarine- og chokoladeindustrien [1].
Teknisk betydning af de polymorfe former
De polymorfe former af triglycerider har forskellige fysiske egenskaber, hvoraf nogle kan være uønskede i fødevarer. Der skal derfor tages visse hensyn i produktionen af f.eks. margarine og chokolade for at fremstille et ensartet produkt, hvis kvalitet er stabil over en vis tid. Fra et teknisk synspunkt er det overgangen b’ til b, der har størst betydning. Ved dannelse af b-fasen i margarine ændres fedtstoffets tekstur, og resultatet er en uønsket grynet fornemmelse i munden [2].
Tilsvarende kendes det uønskede fænomen bloom, når chokoladen får en mat og grålig glansløs overflade. Det skyldes lysspredning fra store fedtkrystaller på overfladen eller fra små sprækker, der indeholder luft. For at mindske risikoen for dannelsen af bloom er det nødvendigt at forkrystallisere produktet under produktionen, hvilket gøres ved at behandle chokoladen med en temperaturprofil. Tempereringen starter med afkøling af fedtstoffet, indtil krystallisationen starter. Derefter varmes der op til en temperatur, hvor krystallitterne i de ustabile lavtsmeltende polymorfe former smelter, så kun den ønskede polymorfe form forbliver krystalliseret. Variationer i fedtsyrernes indbyrdes længde i et triglycerid kan nedsætte hastigheden af b’ til b-overgangen [4].
Fedtstofanalyser foretaget ved Kemisk Institut, Aarhus Universitet
Røntgenpulverdata er blevet optaget på et STOE pulverdiffraktometer ved anvendelse af Cu Ka-stråling. Fire fedtstoffer er undersøgt over en periode på 10 måneder: tristearin, AAK1, AAK2f og AAK2m. De tre sidstnævnte fedtstoffer er produkter fra firmaet AarhusKarlshamn. Fedtstofferne blev behandlet i temperaturintervallet -10° til 60°C, hvilket svarer til det område fedtstofferne i praksis udsættes for i forbindelse med produktion og salg. Prøverne til pulverdiffraktionsanalyserne blev fremstillet ved smeltning af fedtstofferne ved 60°C (Tristearin-prøverne blev smeltet ved 90°C), hvorefter en dråbe fedtstof blev placeret på en prøveholder. Der blev fremstillet to identiske prøver, som dernæst blev afkølet i hhv. køleskab (5°C) og fryser (-10°C) i 30 min. Prøverne blev efterfølgende udelukkende opbevaret ved stuetemperatur (svarende til de betingelser chokolade udsættes for i butikken og hos forbrugeren). For at følge korttids- og langtidsudviklingen blev der optaget pulverdiagrammer af prøverne for de enkelte fedtstoffer. Ved undersøgelse af fedtstoffers krystalformer kan pulverdiffraktion kombineres med differential scanning calorimetry, DSC, hvor faseovergange, herunder prøvens smeltepunkt, kan bestemmes. Desværre sletter DSC-målinger pga. smeltning den »termiske forhistorie« af en prøve. Derimod kan der måles adskillige pulverdiagrammer på en prøve, så fedtstoffets langtidsudvikling kan følges. DSC-målingerne er udført på et PL Thermal Sciences termisk analyseudstyr.
Prøver
Tristearin
Triglyceridet tristearin består af glycerol forestret til tre stearinsyre-molekyler (CH3(CH2)16COOH). Den fra AarhusKarlshamn udleverede tristearinprøve blev ikke omsmeltet umiddelbart efter modtagelsen, og som det ses af tabel 1, antog prøven b-formen. En ny prøve blev dernæst forberedt ved omsmeltning; den antog a-formen, som ikke ændredes over syv måneder (figur 1). Det vides ikke, hvilken termisk historie den udleverede tristearin i b-formen havde. Tristearin skal ikke nødvendigvis tempereres for at få b-formen, men blot køles langsommere under krystalliseringen. Den krystalliserede a-form omlejrer ikke til andre krystalformer ved stuetemperatur og er derfor kinetisk stabil.
Ud over de i tabel 1 beskrevne karakteristiske d-værdier, observeres reflekser ved lave vinkler med d-værdier omkring 16-18 Å. Længden af en mættet carbonkæde på hhv. 16 og 18 carbonatomer er omtrent 19 Å og 21 Å. De observerede lavvinkelreflekser relaterer til kædelængden, idet vinklen mellem kædeaksen og krystalplanerne er forskellig fra 90°. d-værdierne kan beskrives som en lineær funktion af antallet af CH2-grupper i fedtsyren. Der kan ligeledes observeres lavvinkelreflekser for AAK1 og AAK2m.
AAK1
Fedtstoffet AAK1 krystalliserer langsomt under dannelse af en b’-form (tabel 1). Formen er stabil, idet diffraktionsmønstret ikke ændrer sig med tiden (figur 2). Intensiteten af refleksen ved 3,97 Å falder med tiden relativt til de øvrige reflekser. Det kan skyldes forskelle i baggrundsintensiteterne ved de forskellige målinger, eller at en del af AAK1 krystalliserer på en måde, der ikke forklares ud fra den simple model i tabel 1. Sidstnævnte understøttes af, at der ses mere end to reflekser i pulverdiagrammet. Herunder ses en svag refleks ved 4,6 Å, der ikke er dominerende som i en b-form, og den relative intensitet af denne refleks vokser ikke betydeligt med tiden, som det ville være tilfældet ved en omlejring fra b’- til b-formen. Det er et eksempel på, at krystallisering af stoffer med lignende, men ikke identisk, molekylær struktur og blandinger af sådanne forbindelser ikke stringent følger tabel 1.
AAK2
AAK2 er et nyt vegetabilsk specialfedtstof, der vinder indpas i chokolade- og konfektureindustrien. AAK2 separeres under produktionen i flere fraktioner.
AAK2f er den lavtsmeltende fraktion af AAK2. Pulverdiagrammet viser både lige efter udkrystallisationen og efter 10 måneder en meget bred top, hvilket indikerer, at stoffet er amorft (figur 3).
AAK2m er en højere smeltende fraktion af AAK2. Det første pulverdiagram på figur 4 er målt en halv time efter krystallisationen. Det viser en enkelt dominerende top ved 4,11 Å, der indikerer en a-form. Allerede 2,5 time efter krystallisationen begynder der at dannes en skulder ved lidt højere d-værdier, samtidig med at der kommer en top ved 3,87 Å. Det tyder på en omdannelse mod en b’-form. Faseskiftet er indikeret endnu tydeligere efter et døgn, hvor der stadig er noget af a-formen til stede. Den kvantitative sammensætning kan ikke bestemmes ud fra pulverdiagrammerne grundet sammenfaldet af toppen ved 4,2 Å for de to faser. DSC-målinger tyder på, at fedtet efter et døgn består af en blanding af a- og b’-fasen. Pulverdiagrammerne på figur 4 viser endvidere, at der over længere tid sker en fortsat omdannelse til b’-formen. På 10 måneders diagrammet observeres det, at der er opstået en linje ved 4,6 Å. Hvis denne refleks ikke er en del af b’-diagrammet, som det er tilfældet i AAK1, tyder det på, at der i det lange løb dannes en mindre mængde b-fase. Konklusionen er derfor, at hvis b-fasen opstår, sker det først adskillige måneder efter krystallisationen.
Konklusion
For tristearin er a- og b-krystalformerne eftervist. a-formen dannes ved krystallisation direkte fra en smelte ved afkøling i køleskab og fryser. b-formen er påvist for tristearin udleveret af AarhusKarlshamn.
For de tre fedtstoffer, der er produkter fra AarhusKarlshamn, er det blevet påvist, at AAK2f er amorf i mindst 10 måneder ved opbevaring ved stuetemperatur. AAK1 antager i løbet af få timer den ønskede b’-form. Refleksen ved 4,6 Å er ikke dominerende og vokser ikke i ift. de andre reflekser i løbet af de første ti måneder efter krystallisationen. Denne refleks stammer altså ikke fra en b-form.
AAK2m omlejrer i løbet af få timer fra a- til b’-formen. Efter 10 måneder er b’-formen dominerende. Det kan ikke udelukkes, at der er opstået lidt af b-formen efter 10 måneder.
De undersøgte fedtstoffer har altså forskellige strukturer. Krystalliniteten har indflydelse på fedtstoffets fysiske egenskaber og anvendelsesmuligheder samt deres forarbejdning. Det er umiddelbart en stor fordel, at fedtstofferne efter få timer antager strukturer, der er forholdsvis stabile over 10 måneder. Det betyder, at der ikke sker en struktur- og derved teksturændring af fødevaren inden for det tidsinterval. Det amorfe fedtstof AAK2f kan desuden anvendes uden temperering.
For alle de fire fedtstoffer gælder, at der i pulverdiagrammerne ikke er observeret forskelle mellem identiske prøver nedkølet i fryser og i køleskab. Det betyder, at nedkølingsraten i dette tilfælde er ubetydelig for krystalformen af de undersøgte fedtstoffer.
Diffraktion
Hvis et stof har langtrækkende orden kaldes det krystallinsk, og der er en enhed i strukturen, enhedscellen, som ved translation i tre dimensioner opbygger det krystallinske stof. Derimod har et amorft stof kun kortrækkende orden. Røntgenkrystallografi kan give information om enhedscellens opbygning. Røntgenpulverdiffraktion er en meget anvendt og forholdsvis simpel teknik til karakterisering og identificering af krystallinske materialer. Ligeledes kan det kvantitative forhold mellem forskellige faser af et materiale ofte bestemmes.
Et optisk gitter består af mange fuldstændigt parallelle transparente linjer med en afstand, der er større end lyskildens bølgelængde. Sendes lyset ind i det optiske gitter, virker alle linjerne som sekundære lyskilder, der ifølge Huygens princip udsender lys i alle retninger. I nogle retninger er lyset fra de forskellige linjer i fase, og der opstår konstruktiv interferens. Der ses kun lys i de retninger, hvor der er konstruktiv interferens.
En krystal er et regulært, tredimensionelt arrangement af atomer, der danner forskellige planer. På samme måde som linjerne i det optiske gitter kan planerne diffraktere lys med en bølgelængde, der er sammenlignelig med afstanden mellem atomerne, hvilket typisk er omkring 1-3 Å (1 Å = 10-10 m). Afstanden mellem to identiske krystalplaner kaldes d-værdien. Interferensbetingelsen udtrykkes ved Braggs lov, hvor l er bølgelængden, og qhkl er spredningsvinklen for krystalplanen:
nl = 2dhklsinqhkl, n = 1, 2, 3, …
Et pulverdiagram viser intensiteten af det diffrakterede lys som funktion af 2q. Linjernes positioner i pulverdiagrammet bestemmes af enhedscellens størrelse og form, mens intensiteten bestemmes af atomtyperne og deres positioner i enhedscellen. Et pulverdiagram for et krystallinsk materiale har skarpe reflekser, hvorimod et pulverdiagram for et amorft stof ikke giver veldefinerede reflekser pga. den manglende langtrækkende orden. Ved brug af Braggs lov kan man ud fra refleksernes 2q-værdier opnå information om de karakteristiske d-værdier for det krystallinske stof.
Fedtstofkrystallografi
Orienteringen af en fedtsyres zigzagmønstrede carbonkæder i forhold til nabofedtsyrernes kæder betyder, at fedtstoffer findes i flere polymorfe former. Der er kun én termodynamisk stabil form af et givet triglycerid. Der kan være en stor energibarriere for omdannelsen mellem to faser, og reaktionshastigheden for omdannelsen fra en metastabil til den stabile fase kan derfor være meget lav. De metastabile faser kan altså være kinetisk stabile, så fedtstoffet ikke nødvendigvis omdannes inden for fødevarens holdbarhedsperiode.
Kulbrintemolekyler med lange carbonkæder, herunder fedtsyrer, pakker i fast fase uafhængigt af funktionelle grupper. Pakningen af kæderne kan beskrives ved indførelse af en subcelle. Subcellen er den mindste repetitionsenhed inden for et kædelag. Den beskriver det tredimensionelle forhold mellem ækvivalente translationsrelaterede positioner inden for en eller to kulbrintekæder (afhængigt af krystalsystem) og kæderne ved siden af den/dem. Subcellen defineres ved akserne as, bs og cs samt de tre vinkler mellem akserne. cs er translationen mellem ækvivalente positioner i samme kulbrintekæde, mens as og bs er translationer til siden. Der er defineret subceller, der tilhører det trikline, det monokline, det orthorhombiske og det hexagonale krystalsystem. En carbon-carbon-zigzagkædes plan er altid vinkelret på eller parallel med nabokædernes. Subcellepakningen beskrives ud fra subcellesymmetrien og ud fra, om nabokæder er indbyrdes parallelle eller vinkelrette. De forskellige subcellepakninger kan karakteriseres ved røntgenpulverdiffraktion, da hver pakning er karakteriseret ved et unikt sæt d-værdier mellem 3,5 og 5,5 Å. For de forskellige polymorfe former af fedtkrystaller (figur 5 og 6) anvendes nomenklaturen defineret i tabel 1 [2,3].
Sædvanligvis opfattes fedtstoffer ikke som krystallinske stoffer som f.eks. køkkensalt og sukker, men der er langtrækkende orden i mange fedtstoffer [2]. Den termodynamisk mest stabile form er b-formen, og den mest ustabile er a-formen. For nogle fedtstoffer findes der flere b’-former, der nummereres efter aftagende smeltepunkt. Et højere smeltepunkt indikerer, at der skal relativt mere energi til at bryde pakningen af molekylerne. Den fuldstændige sekvens af faseovergange for triglycerider kan være givet som illustreret i figur 7. b-formen kan dannes direkte fra enten en smelte eller et solvent, så fedtstoffet ikke omlejrer med tiden. Da faserne gradvis opnår en lavere Gibbs-energi ved den polymorfe transformation, er faseomdannelsen irreversibel.
Referencer
1. Brancheudvalgene med sekretariat i Industrifagene. Fagområde Procesindustrien: Oliekemi. 1986.
2. Garti, N., Sato, K. Crystallization and Polymorphism of Fats and Fatty Acids, Marcel Dekker, 1988.
3. Small, D.M. The Physical Chemistry of Lipids. From Alkanes to Phosphorlipides, Plenum Press, New York, 1986.
4. van Malssen, K.; van Langevelde, A.; Peschar, R., Schenk, H. Recent Res. Devel. Oil Chem. 1999, 3, 141.
5. Chapman, D. The Structure of Lipids, Methuen and Co Ltd., London, 1985.
Figur 1. Røntgenpulverdiagrammer af tristearin i b- og a-formen.
Figur 2. Pulverdiagram af AAK1 i b’-formen som funktion af tiden.
Figur 3. AAK2f er amorf.
Figur 4. AAK2m krystalliserer i a-formen, men omdannelsen til b’-formen begynder allerede efter 2,5 time.
Figur 5. Triglycerider i forskellige krystalstrukturer. Fra venstre: a (rotationel uorden), b’ (vinkelrette kæder) og b (parallelle kæder).
Figur 6. Subcellerne set langs kædeaksen [2]. (a) Hexagonal pakning (rotationel uorden), (b)-(c) To orthorhombiske subceller, (d) Triklin subcelle.
Figur 7. Faseovergange mellem polymorfe former. Efter [2].
Tabel 1. Fedtstoffers krystalformer.
