En nyligt afsluttet ph.d.-afhandling havde udvikling af kvantitative analysemetoder til væskekromatografi og undersøgelse af enzymkatalyseret syntese af sukroselaurat som hovedtemaer. Her beskrives arbejdet.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 8, 2014 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Aleksander Lie, postdoc, Lars Haastrup Pedersen, lektor og ph.d.-vejleder, Sektion for Bioteknologi, Institut for Kemi og Bioteknologi, Aalborg Universitet
Ph.d.-arbejdet blev udført som del af et samarbejdsprojekt, støttet af Det Frie Forskningsråd, mellem Sektion for Bioteknologi, AAU, DTU Kemiteknik, Center for Bioprocess Engineering ved professor Anne S. Meyer, og Aalborg Universitetshospital, Mikrobiologisk Afdeling ved professor Henrik C. Schønheyder.
Metoder til kvantitativ analyse af regioisomerer af sukrosekaprat of sukroselaurat ved omvendt-fase væskekromatografi (RP-HPLC) med charged aerosol detection (CAD) blev undersøgt og udviklet. Undersøgelserne analyserede en række elueringsstrategier, som resulterede i metoder til effektiv separation og identifikation af alle regioisomerer af de to forbindelser [1,2]. Enzymkatalyseret syntese af sukroselaurat i den polære, aprotiske solvent N,N-dimetylformamid (DMF) blev undersøgt mht. enzymaktivitet og -selektivitet af en række enzympræparater. Alle reaktioner viste selektivitet for dannelse af 2-O-lauroylsukrose, og metalloproteasen termolysin viste den højeste aktivitet [3].
Fedtsyreestre af sukrose – egenskaber og brug
Fedtsyreestre af sukrose finder udstrakt brug i fødevarer, kosmetik og lægemidler. Disse forbindelser er særligt interessante pga. deres emulgerende, dispergerende og organoleptiske egenskaber, kombineret med lav toksicitet, lav grad af immunostimulerende effekt og biologisk nedbrydelighed.
Fedtsyreestre af sukrose er godkendt som tilsætningsstof i fødevarer (E473) i store dele af verden, og lav-substituerede sukrosealkanoater produceres som emulgatorer til fødevarer og kosmetik. Antimikrobielle egenskaber er påvist for monoestere med fedtsyrekædelængder på 10-16 kulstofatomer. Især sukroselaurat, kondensationsproduktet af sukrose og laurinsyre, har vist antimikrobielle egenskaber mod en række bakteriefamilier.
Fremstilling af sukroseestre
Sukrose er en polyfunktionel forbindelse med otte hydroxy-grupper som kan danne mange produkter ved enkle reaktioner (figur 1). Esterdannelse med en enkelt fedtsyre kan give ophav til otte regioisomerer, noget der gør selektiv esterificering af sukrose udfordrende, både ved brug af kemisk og enzymatisk katalyse. Kemisk katalyse udføres sædvanligvis ved høj temperatur, hvilket kan medføre lav selektivitet og misfarvede biprodukter. Betydelig højere selektivitet er påvist for enzymkatalyserede processer under mildere reaktionsbetingelser. Enzymer er effektive katalysatorer, der fungerer i moderate pH- og temperaturområder og har lavt miljøaftryk. Estersyntese kan katalyseres af hydrolytiske enzymer, som lipaser eller proteaser, ved lav vandaktivitet i organiske solventer. Varierende grad af selektivitet har været rapporteret for flere substituentpositioner i forbindelse med esterificering af sukrose. De mest favoriserede positioner er 2-, 6- og 1′-OH.
RP-HPLC-analyse
RP-HPLC er en velegnet analysemetode til direkte analyse af sukre og sukkerderivater. Kombineret med CAD – en detektionsmetode, der er uafhængig af bestemte fysisk-kemiske egenskaber ved de analyserede forbindelser og meget egnet til kulhydrater, fedtsyrer og lipider – kan både sukrose og sukroseestre separeres, detekteres og kvantificeres. Forskellige elueringsstrategier blev undersøgt med eksperimentel design og statistisk og multivariat analyse. Strategierne inkluderede isokratisk eluering, step-down-gradienteluering (figur 2b) og varieret flow-hastighed under isokratiske betingelser. De undersøgte faktorer for disse strategier var defineret som designvariable (tabel 1). De udviklede metoder til RP-HPLC-analyse af sukrosekaprat og sukroselaurat resulterede i separation af alle otte regioisomerer af de to forbindelser, og identifikation af regioisomererne vha. NMR (figur 2) [1,2].
Analyse og vurdering af kromatografisk separation af flere komponenter
Separation af komponenter ved RP-HPLC-analyse bliver typisk vurderet fra beregnede værdier for resolution (Rs), som angiver grad af overlap mellem to nærliggende toppe. I dette arbejde, hvor separation af otte komponenter var af interesse, opstod der et behov for at vurdere de resulterende syv Rs-værdier samlet. Til dette formål blev der udviklet en matematisk funktion til beregning af et måltal for total separation, benævnt general resolution deviation for multiple peaks (RDm). Denne funktion var baseret på standardafvigelse for stikprøve, som giver nøjagtigheden af et sæt værdier sammenlignet med deres gennemsnit, dvs. målværdien. Værdien for optimal resolution (Rs = 1.5) blev brugt som målværdi, og funktionen blev gjort prøveuafhængig ved at beregne topbredder for alle toppe fra toppen med størst areal, og sådan udligne toppenes størrelser. Ligning 1 viser den fuldstændige funktion:
hvor t_”R” er retentionstid, ω ̅ er hældningstal for topbredde, n er antal komponenter vurderet, i∈[2,n], eftersom antallet resolution-værdier altid er n-1, og a er en skaleringskonstant. Ved at skalere med a=1/1.5 får funktionen en værdimængde fra 0 til 1, og værdien er omvendt proportional med summen af resolution-værdierne [2].
Effektivitet af elueringsstrategier
De undersøgte elueringsstrategier blev sammenlignet mht. total separation udtrykt ved RDm, og total analysetid (figur 3), og effektiviteten blev optimeret ved minimering af de to værdier. Den mest effektive elueringsmetode til analyse af sukrosekaprat var step-down-gradienteluering, mens isokratisk eluering med øget flowhastighed gav bedre effektivitet for sukroselaurat [2].
Enzymkatalyseret syntese af sukroselaurat
En række enzympræparater af proteaser blev anvendt til esterificering af sukrose med vinyllaurat i DMF. Reaktioner blev udført med præparaterne termolysin, ALP-901, subtilisin A og Alcalase 3.0T samt kontrolreaktioner med proteinet kasein og uden protein, for at undersøge præparaternes selektivitet og aktivitet. Alle udførte reaktioner gav dannelse af sukroselaurat, med 2-O-lauroylsukrose dannet i højest mængde. Udbytter af produkt varierede fra 12% til 53%. Højest aktivitet blev observeret for termolysin, efterfulgt af ALP-901, og kontrolreaktion uden protein. Regioisomerfordeling for reaktionerne efter 48 timer viste små variationer for alle reaktioner, bortset fra reaktionen med termolysin, der resulterede i en unik regioisomerfordeling (figur 4). Resultaterne viste, at solventen i høj grad inducerede selektiviteten i de undersøgte reaktioner [3].
Referencer:
Lie, A., Wimmer, R., og Pedersen, L.H. J. Chromatogr. A 2013, 1281, 67-72.
Lie, A., og Pedersen, L.H. J. Chromatogr. A 2013, 1311, 127-133.
Lie, A., Meyer, A.S, og Pedersen, L.H. Appearance and distribution of regioisomers in metallo- and serine-protease-catalysed acylation of sucrose in N,N-dimethylformamide. J.Mol. Catal. B: Enzym. 2014. DOI: 10.1016/j.molcatb.2014.04.017
Regioisomeri
Forbindelser med ens kemisk sammensætning, men med forskelle i position af funktionelle grupper eller substituenter på molekylets hovedstruktur, kaldes regioisomerer.
