Brug af enzymer til organisk syntese er ikke nødvendigvis en sidste udvej når traditionelle kemiske metoder fejler. En række enzymatisk katalyserede transformationer er veldokumenterede og udføres let med kommercielt tilgængelige enzymer. Det illustreres her med eksempler på reaktioner katalyseret af en immobiliserede lipase, Novozym 435.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 9, 2008 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Jesper Brask, Novozymes A/S
Katalyse i organisk kemi har potentiale til at levere hurtigere reaktioner under mildere betingelser i færre trin (uden beskyttelsesgrupper, m.m.). Katalytiske reaktioner kan opdeles i de kemisk katalyserede og de biokatalyserede. For førstnævntes vedkommende har der i de seneste årtier været meget fokus på overgangsmetalkomplekser [1]. Biokatalyse området kan opdeles i brug af isolerede enzymer eller hele celler. Hele, døde eller levende celler anvendt til organisk syntese katalyserer ofte kun et enkelt procestrin. I modsætning hertil benyttes ”metabolic engineering” til at få levende mikroorganismer til at omdanne simple substrater til komplekse produkter [2]. Denne artikel fokuserer dog udelukkende på brugen af isolerede enzymer som et værktøj til organisk syntese.
Blandt syntesekemikere var det i mange år en udbredt opfattelse at enzymer er skrøbelige molekyler som kun virker i vandig opløsning. De seneste 20 år er der dog publiceret talrige eksempler på enzymer, der virker under betingelser, der ligger meget langt fra hvad enzymerne er designet til fra naturens side. ”Opdagelsen” at nogle enzymer også har aktivitet i organiske solventer tillægges ofte Klibanov, selvom der er tidligere eksempler. Ofte er ikke-vandige solventer påkrævet p.g.a. opløselighedsproblemer eller for at drive en reaktion til en ønsket ligevægt (f.eks. lipase-katalyseret hydrolyse/kondensation). Mens biokatalyse tidligere ofte blev anset som en sidste og usandsynlig udvej når alle andre muligheder var udtømte, er det nu en etableret disciplin der sideløbende komplementerer klassisk organisk syntese inden for farma- og anden kemisk industri. Fordelene ved biokatalyse er da også indlysende, idet enzymer ofte tilbyder fremragende kemo-, regio- og/eller enantioselektivitet under milde reaktionsbetingelser.
Populære enzymer til biokatalyse
Mange farmaceutiske virksomheder har nu egne mikrobiologiske- og molekylærbiologiske afdelinger, der kan levere enzymer til screening af ønskede transformationer. I universitetsmiljøerne er lignende samarbejder ofte mulige. Alternativt kan kommercielt tilgængelige enzymer afprøves. Heldigvis findes de i stort antal, hvor de kan købes direkte fra de store producenter (som Novozymes), eller – specielt hvis der er talte om små mængder – fra distributører og mindre enzymproducenter der fokuserer på biokatalyse (BioCatalytics, Amano, etc.). Her kan man også ofte købe ”kits” indeholdende en række enzymer med forskellige specificitet. Kemikalieleverandøren Sigma-Aldrich har en bred vifte af enzymer til biokatalyse, inklusiv Novozym 435, der omtales senere.
Enzymer katalyserer forskellige klasser af meget forskellige reaktioner (se Faktaboks 1), men ikke alle er lige relevante eller egnede til organisk syntese. De mest populære enzymer til biokatalyse synes at være:
1) Lipaser. Den mest anvendte enzymklasse til biokatalyse, eftersom lipaser typisk accepterer en lang række substrater og er meget stabile i ikke-vandige systemer. Lipaser udnyttes således i hydrolyse og acyleringsreaktioner, hvor ligevægten er kontrolleret af vand aktiviteten, og ofte med kemo-, regio-, og/eller enantioselektiv kontrol. Med amin-nucleophiler kan lipaser tillige lave amider, d.v.s. syntesen af disse er ikke begrænset til peptidaser. Serin-hydrolase lipaser og peptidaser testes da også ofte til de samme biokatalytiske reaktioner. Til acyleringsreaktioner benyttes typisk aktiverede acyl-donorer som vinyl estre eller syreanhydrider. Med vinyl estre er reaktionen drevet af, at vinyl alkohol tautomeriserer til flygtig acetaldehyd. Sådanne aktiverede acyl-donorer reagerer dog spontant med primære aminer, hvorfor ethylacetat typisk benyttes til acylering (acetylering) i disse tilfælde.
2) Oxidoreduktaser. Alkohol dehydrogenaser (ADH) har fundet værdifulde anvendelser inden for enantioselektive keton reduktioner, der sammen med enantioselektive hydrolyse og acyleringsreaktioner dominerer farma-områdets brug af biokatalyse. Oxidaser som cyclohexanon monooxygenase (CHMO) anvendes til selektive Baeyer-Villiger reaktioner og laccaser har fundet anvendelse til TEMPO-medieret oxidation af primære alkoholer til aldehyder. Som gruppe er der således voksende interesse for oxidoreduktaser til organisk syntese, selvom de traditionelt er anset for mere besværlige end f.eks. lipaser. Dette hænger sammen med at mange kræver co-faktorer som NADH. Benyttes hele celler er co-faktoren inkluderet, men med isolerede enzymer må det tilsættes. Co-faktorer er kommercielt tilgængelige, men dyre. På det seneste er der dog publiceret flere gode procedurer til regenerering, f.eks. af NADH via in situ ADH-katalyseret oxidation af 2-propanol.
3) Nitrilaser. Disse enzymer hydrolyserer nitriler til carboxylsyrer. En relateret aktivitet findes hos nitril hydrataser, der hydrolyserer nitriler til amider. Begge er meget efterspurgte inden for biokatalyse, når milde betingelser til nitril hydrolyse er påkrævet. En immobiliseret nitril hydratase benyttes industrielt i meget stor skala til at producere acrylamid ud fra acrylonitril.
Eksempler med Novozym 435
Den mest kendte og anvendte lipase til biokatalyse er fra gæren Candida antarctica. Den såkaldte ”lipase B” (CALB) blev oprenset og karakteriseret af forskere hos Novozymes i 1993 [3] og strukturen blev opklaret i 1994. CALB sælges af Novozymes i både flydende formulering, såvel som immobiliseret, hvor den kaldes Novozym 435 (Figur 1 og 2). Novozym 435 kan opbevares ved stuetemperatur i årevis uden aktivitetstab og i reaktionsblandinger kan enzymet fungere ved op til 90 ◦C (f.eks. med toluen som solvent). Enzymet har høj aktivitet (og ofte også selektivitet) på en række forskellige substrater som illustreret med nedenstående appetitvækkende eksempler.
En tidlig anvendelse af Novozym 435 er syntesen af 6-O-acylglucopyranosider [4]. CALB forestre selektivt den primære alkohol i 6-positionen (Figur 3A). Disse ”sukker estre” har fundet anvendelse som bionedbrydelige surfaktanter. Det blev ligeledes hurtigt opdaget at CALB accepterer H2O2 som nucleophil og således kan katalysere dannelsen af peroxycarboxylsyrer fra estre eller carboxylsyrer [5]. Persyren kan f.eks. anvendes in situ til epoxideringer (Figur 3B).
Der er talrige eksempler på kinetiske resolveringer, specielt med sekundære alkoholer. Som nævnt kan ethylacetat benyttes både som solvent og acyl-doner ved acylering af aminer (Figur 3C) [6]. Den viste reaktion udviser Kazlauskas selektivitet (se Faktaboks 2). I et andet eksempel, med en primær alkohol, benyttes et cyclisk syreanhydrid som acyl-doner, idet produktet da let separeres ved simpel basisk ekstraktion (Figur 3D) [7].
Kinetiske resolveringer kan maksimalt give 50% udbytte. Benyttes prochirale substrater eller meso-former kan udbyttet komme op på teoretisk 100%. Det er bl.a. udnyttet af forskere fra Schering-Plough i en Novozym 435 katalyseret forestring af en 2-substitueret-1,3-propandiol (Figur 3E). Reaktionen er rapporteret til at give >95% ee med <2% diol tilbage [8]. Alternativt kan en resolvering kombineres med hurtig in situ racemerisering af substratet i en dynamisk kinetisk resolvering (DKR). Kombinationen af biokatalyse (lipase-katalyseret resolvering) og overgangsmetal-katalyseret racemerisering er bl.a. udviklet af Bäckvall [9]. Udbytter op til 99% med ee >99% er rapporteret for både sekundære alkoholer og primære aminer (Figur 3F).
Konklusion
Enzymatiske processer er veletablerede med en lang historie inden for en række industrier, men brugen af enzymer til organisk syntese er stadig en relativ ung disciplin under udvikling. Udviklingen af en enzymatisk proces kan være en endog meget stor opgave, der involverer screening og test af tusindvis af enzymvarianter under forskellige betingelser. I andre tilfælde er reaktionen mere standard, og et kommercielt tilgængeligt enzym kan anvendes som et hvilket som helst andet laboratoriekemikalie. Den immobiliserede lipase Novozym 435 har således vist sig at være et meget alsidigt værktøj til organisk syntese.
Faktaboks 1: Enzym klassificering
Enzymer kan klassificeres efter deres funktion efter EC systemet, hvor en 4-cifret kode angiver hovedklasse og underklasser. De seks EC hovedklasser er:
1) Oxidoreduktaser. Disse enzymer katalyserer redox-reaktioner. Eksempler er oxidaser der katalyserer oxidationer ved at reducere O2 og peroxidaser der reducerer H2O2, laccaser (EC 1.10.3.2) der er oxidaser der katalyserer oxidationen af (poly)phenoliske substrater, og reduktaser og dehydrogenaser (EC 1.1.1) der reducerer carbonyl-forbindelser v.h.a. NADH/NADPH co-faktorer.
2) Transferaser. Disse enzymer flytter en gruppe (f.eks. alkyl eller glycosyl) fra substrat til acceptor-forbindelse.
3) Hydrolaser. Katalyserer hydrolyse af C-O og C-N (og få andre) bindinger. Eksempler på underklasser er: 3.1 esteraser (inklusiv 3.1.1.3 lipaser), 3.2 glycosidaser, 3.4 peptidaser.
4) Lyaser. Disse enzymer kløver typisk C-C, C-O eller C-N bindinger ved elimination, hvorved der typisk efterlades dobbeltbindinger.
5) Isomeraser. Et industrielt vigtigt eksempel er glucose isomerase (EC 5.3.1.18) der katalyserer isomeriseringen af D-glucose til D-fructose.
6) Ligaser. Kobler hydrolyse af ATP eller lignende til dannelsen af højenergi-bindinger mellem to substrater.
Faktaboks 2: Kazlauskas’ regel
Lipaser udviser ofte fremragende enantioselektivitet ved kinetisk resolvering af sekundære alkoholer, mens primære og tertiære alkoholer generelt er mere udfordrende. ”Kazlauskas’ regel” forudsiger hvilken enantiomer der reagerer hurtigst ved acylering af en sekundær alkohol [10]. Modellen er gengivet nedenstående (Figur 4) sammen med tilsvarende, men mindre pålidelige modeller for visse chirale primære alkoholer [11] og carboxylsyrer [12]. ”M” og ”L” angiver ”medium” og ”large” substituenter. Ifølge denne model er det typisk (R)-formen af en sekundær alkohol der acyleres hurtigst, eller – for den modsat rettede hydrolyse reaktion – (R)-formen af den modsvarende ester, der hydrolyseres hurtigst. Jo større størrelsesforskellen er mellem ”M” og ”L”, jo bedre enantioselektivitet. Meget store, forgrenede substituenter kan dog betyde at substraterne ikke kan være i enzymets aktive site og derfor ikke omsættes. Kazlauskas’s regel gælder også for isosteriske primære aminer (M-CHNH2-L), og har vist sig at passe for en meget bred vifte af lipase-katalyserede resolveringer.
Faktaboks 3: Enzym immobilisering
Hvis vand i reaktionsblandingen ikke er et problem, kan enzym katalysatoren tilsættes i form af en vandig opløsning (typisk med en buffer indstillet til enzymets pH-optimum). Alternativt kan enzymet frysetørres, men det er risikabelt, da indånding af enzymstøv kan medføre udvikling af allergi. En god løsning, især hvis det er vigtigt ikke at introducere vand i reaktionen, kan være at bruge et immobiliseret enzym. Immobiliserede enzymer har således også en række andre fordele:
· Kan fjernes fra reaktionsblandingen ved simpel filtrering
· Kan let genanvendes i en ny batch reaktion
· Let håndtering og dosering
· Immobiliserede enzymer er stabile og kan typisk opbevares ved stuetemperatur
· Mulighed for at pakke immobiliserede enzymer i kolonner
På den anden side er der også visse ulemper:
· Tab af aktivitet som følge af immobiliseringsprocessen
· Nedsat reaktivitet som følge af diffusionsbegrænsninger
· Kan ikke bruges sammen med uopløselige substrater
· Ekstra arbejde/omkostninger i.f.m. immobilisering
Mange immobiliserede enzymer er kommercielt tilgængelige. Alternativt er det relativt enkelt selv at immobilisere. Lipaser kan typisk immobiliseres ved simpel adsorption på en porøs hydrofob bærer (f.eks. polypropylen, ”Accurel”). Immobiliserings-proceduren består her blot i at suspendere bæreren i en opløsning af enzymet, og filtrere det immobiliserede enzym fra når alt er adsorberet. I andre tilfælde udnyttes ioniske interaktioner mellem enzym og en ionbytter resin, eller enzymet bindes kovalent til bæreren (f.eks. ved reaktion med epoxy-grupper, ”Eupergit”).
Referencer:
[1] R. Madsen, D. Tanner, M. Johannsen, Dansk Kemi 2001, 82, 19-21.
[2] L. Olsson, J. M. Otero, K. Patil, J. Nielsen, Dansk Kemi 2007, 88, 24-26.
[3] Patkar, S. A. Björkling, F. Zyndel, M. Schulein, M. Svendsen, A. Heldt-Hansen, H. P. & Gormsen, Indian J. Chem., Sect. B 1993, 32, 76-80.
[4] K. Adelhorst, F. Björkling, S. E. Godtfredsen, O. Kirk, Synthesis 1990, 112-115.
[5] F. Björkling, S. E. Godtfredsen, O. Kirk, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990, 1301-1303.
[6] J. González-Sabín, V. Gotor, F. Rebolledo, Tetrahedron: Asymmetry 2002, 13, 1315-1320.
[7] G. de Gonzalo, R. Brieva, V. M. Sánchez, M. Bayod, V. Gotor, J. Org. Chem. 2003, 68, 333-3336.
[8] B. Morgan, D. R. Dodds, A. Zaks, D. R. Andrews, R. Klesse, J. Org. Chem. 1997, 62, 7736-7743.
[9] O. Pàmies, J.-E. Bäckvall, Chem. Rev. 2003, 103, 3247-3261.
[10] R. J. Kazlauskas, A. N. E. Weissfloch, A. T. Rappaport, L. A. Cuccia, J. Org. Chem. 1991, 56, 2656-2665.
[11] A. N. E. Weissfloch, R. J. Kazlauskas, J. Org. Chem. 1995, 60, 6959-6969.
[12] S. N. Ahmed, R. J. Kazlauskas, A. H. Morinville, P. Grochulski, J. D. Schrag, M. Cygler, Biocatalysis 1994, 9, 209-225.
Figur 1. Novozym 435 består af lipasen CALB adsorberet på en porøs poly-methylmethacrylat resin og kan anvendes til en række organisk syntese reaktioner.
Figur 2. Det årlige antal publikationer med Novozym 435 eller Candida antarctica er stadig stigende. Disse er stort set alle relateret til biokatalyse. ”Web of Science” søgning juli 2008.
Figur 3. Et udvalg af forskellige reaktioner katalyseret af Novozym 435.
Figur 4. Skematisk repræsentation af det aktive site i en lipase, med lommer for ”medium” og ”large” substituenter. Den viste enantiomer vil reagere hurtigst.
