Bioorganisk kemi er et område i stærk vækst. Det forbinder organisk kemi, biokemi, biofysik, medicinalkemi og bioteknologi. Forskning inden for bioorganisk kemi øger forståelsen af biologiske processer på molekylært niveau. I to artikler beskrives nogle udvalgte forskningsprojekter, der illustrerer områdets alsidighed og vigtighed.
Læs 1. del af originalartiklen her
Læs 2. del af originalartiklen her
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 2, 2003 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af lektor Knud J. Jensen og professor John Nielsen, Kemisk Institut, KVL
Grænsefladen mellem kemi og biologi udgør internationalt set et af kemiens store grundforskningsområder. Her kan nye kemiske metoder og syntesen af nye kemiske strukturer give indsigt i væsentlige biokemiske og biofysiske problemstillinger. Inden for organisk kemi er bioorganisk kemisk syntese et bredt forskningsfelt i rivende udvikling. Definitionen på, hvad bioorganisk kemi er, og hvilke områder det omfatter, ændres med tiden. Kort fortalt kan man sige, at bioorganisk kemisk syntese sigter på design, fremstilling og biologisk evaluering af kemiske forbindelser med et umiddelbart biologisk sigte1.
Til forskel fra de andre dele af den organiske kemi, som også syntetiserer biologisk aktive molekyler, omfatter bioorganisk kemi dels syntese af biopolymerer såsom peptider, proteiner, og komplekse kulhydrater, dels bio-mimetics, »små« molekyler, der bruges som prober til belysning af biologiske problemstillinger samt brug af kemoenzymatisk syntese. Hermed fås veldefinerede og skræddersyede forbindelser, der er uundværlige redskaber for studiet af biologiske processer på et molekylært niveau, herunder naturprodukters biosyntese. Det kan føre til udviklingen af nye potentielle lægemidler og være en vigtig forudsætning for bioteknologi, nanoteknologi og specielt nanobioteknologi. Et vigtigt redskab i bioorganisk kemi er metoder til fastfasesyntese og kombinatorisk kemi. Specielt gælder vores interesse kombinatorisk kemi, naturproduktkemi, de novo design og kemisk totalsyntese af modelproteiner og syntese og analyse af oligosaccharider.
Der præsenteres udvalgte emner fra vores forskning i bioorganisk og kombinatorisk kemi. Inden for det sidste halvandet år er vores forskningsgrupper flyttet fra Kemisk Institut på DTU til Kemisk Institut, KVL.
Indarbejdet i oversigtsartiklerne er nogle forslag til definitioner (nomenklatur) for dansk sprogbrug omkring kombinatorisk kemi og syntese på fastfase.
Fastfasesyntese
Udviklingen af kemiske teknikker til fastfasesyntese har siden 1960’erne revolutioneret forskningen først i peptider og siden i oligonucleotider (boks 1). Under fastfasesyntesen er molekylerne bundet til en fastfase, typisk en polymer (et resin); efter syntesens afslutning spaltes slutproduktet fra polymeren. Kombinatorisk kemi har siden de første publikationer i 1991 ført til en sand omvæltning inden for den farmaceutiske og bioteknologiske forskning, idet den gør det muligt at fremstille i hundred- eller tusindvis af nye forbindelser på kort tid. Forbindes det med parallel biologisk eller farmaceutisk undersøgelse (screening) af de nye stoffer, kan man forhåbentligt forkorte den tid, det tager at opdage nye potentielle lægemidler.
Nye linkere til fastfasesyntese
Et centralt tema i KJ’s forskning er udviklingen og anvendelsen af nye linkere (såkaldte »håndtag«) til fastfasesyntese. Som post.doc. i USA udviklede han en linker til at forankre peptider og andre nitrogenholdige organiske forbindelser [1]. Reagenset, Backbone Amide Linker (BAL), indeholder et trisalkoxybenzaldehyd, der tillader forankring af aminer ved reduktiv aminering. Langt de fleste forankringer af den første byggesten til en resin sker ellers via en nukleofil linker. Reaktive elektrofiler hydrolyseres let og undergår sidereaktioner; sidder elektrofilen på fastfasen, fører det til et fald i loading. Undtagelsen herfra er aldehyder i kombination med forankring ved reduktiv aminering. Derudover er reduktiv aminering en meget effektiv og selektiv reaktion, også på fastfase. Peptiderne kan forankres til BAL gennem et amid-nitrogen i peptidets »rygrad« og ikke som ellers gennem den C-terminale syrefunktion (figur 1). Således kan peptider med flere forskellige C-termini fremstilles. Slutprodukterne frigøres fra resinet med opløsninger af trifluoreddikesyre ved stuetemperatur.
BAL-håndtaget er blevet brugt i syntesen af C-terminale peptid-aldehyder [2], amider, og alkoholer samt af cykliske peptider. Der er udviklet en metode til at fremstille C-terminale peptidthioestre, hvor thioesteren under fastfasesyntesen er maskeret som en trithioorthoester (figur 2). C-terminale peptidthioestre er interessante, da de er vigtige byggesten i den »kemiske totalsyntese« af proteiner. BAL er blevet en særdeles anvendt del af peptidkemiens arsenal og bruges også inden for generel fastfasesyntese, ikke mindst i kombinatorisk kemi.
Siden er der også udviklet nye BAL-type linkere. Første led var, at KJ’s gruppe i samarbejde med lektor Jørn B. Christensen, udviklede en regioselektiv og effektiv syntese af ortho regioisomeren af BAL, o-BAL [3]. o-BAL er nemmere tilgængelig end den oprindelige para regioisomer, og den har faktisk de samme egenskaber. I en fortsættelse af dette samarbejde er to helt nye linkere, N-BAL (naphthalen-baseret) og T-BAL (thiophen-baseret, figur 3) fremstillet. Af T-BAL-håndtaget forventes en endnu højere syre-labilitet, dvs. mulighed for at fraspalte slutprodukterne under endnu mildere betingelser end tidligere; dette skulle gerne give større spillerum i syntesen af beskyttede peptider.
Kombinatorisk kemi på naturstoffer:
Chemoselektiv syntese af hapalosinanaloger
I et samarbejde mellem KJ’s og JN’s forskningruppe blev BAL-håndtaget brugt i syntesen af et lille bibliotek af hapalosin-mimetics. Traditionelt set har naturstoffer udgjort omkring 50% af alle lægemidler, og kikker man på lægemidler rettet imod infektionssygdomme eller anti-cancer stoffer, er andelen op imod 65%. I et nyligt review er det blevet godtgjort, at dette stadig er tilfældet, og at kombinationen af kombinatorisk kemi og naturstofkemi udgør et hastigt voksende forskningsområde [4].
Projektets udgangspunkt var den marine metabolit hapalosin, et cyklisk depsipeptid (dvs. en amidbinding er erstattet af en estergruppe i et peptid) med multidrug resistance (MDR) reversing aktivitet. Der er udviklet en fastfasestrategi til at syntetisere hapalosin mimetics, opbygget omkring et polyfunktionelt, aromatisk template (figur 4). BAL-håndtaget udnyttes for at undgå brugen af beskyttelsesgrupper. Strategien er derfor tæt på det maksimale i »atomøkonomi«. Der er syntetiseret et lille bibliotek af stoffer, som skitseret i figur 4, og to af stofferne viste efterfølgende anti-MDR-aktivitet i screeninger foretaget af samarbejdspartnere på Rigshospitalets Kræftafdeling [5].
Saphenic acid og saphenamycin
Søgen efter nye typer antibiotika er en stadig vigtigere forskningsmæssig disciplin, eftersom resistens over for eksisterende antibiotika og multidrug resistens truer mulighederne for at bekæmpe infektionssygdomme. En række marine naturprodukter, der indeholder den heteroaromatiske grundstruktur phenazin, har vist lovende antibiotisk og antitumor-aktivitet. Det gælder særligt flere sekundære metabolitter fra Streptomyces- og Pseudomonas-stammer. Således viser naturstoffet saphenamycin, der er en 6-methylsalicylsyreester af saphenic acid (6-(1-hydroxyethyl)-1-phenazinecarboxylic acid), kraftig antibakteriel aktivitet, hvorfor denne stofgruppe er interessant som potentielle lægemidler. JN’s forskningsgruppe har udviklet en ny syntese af naturstoffet saphenic acid [6], som i sig selv ikke er biologisk aktivt, men som bruges som byggesten i fremstilling af saphenamycin-analoger. Hertil er der udviklet en effektiv syntesestrategi på fastfase, og flere af de nye stoffer, som er blevet syntetiseret ved denne proces, har i efterfølgende screeninger vist endnu kraftigere antibiotisk effekt imod klinisk relevante patogener end stamforbindelsen saphenamycin (figur 5) [7]. I et senere studium er udforskningen af saphenamycin fortsat. Formålet var at kortlægge betydningen af det chirale center, dets mulige virkningsmekanisme og at udvikle den første kendte syntese af naturstoffet [8]. Nu syntetiseres større kombinatoriske biblioteker af saphenamycin-derivater.
I den næste artikel kan man læse om quorum sensing, carboproteiner, fastfase-oligosaccharidsyntese og ny glycosyleringskemi samt fastfaseanalyse og biosyntese af pektinoligosaccharider.
Fodnote 1
Det er selvsagt svært at opstille et entydigt kriterium for, hvornår organisk kemisk syntese bliver til bioorganisk kemisk syntese. Vil man have et praktisk, omend lidt spøgende, demarkationskriterium, så kunne det være, at HPLC-instrumenter er en forudsætning for bioorganisk kemi, og at disse HPLC-instrumenter her er udstyret med omvendt-fase (RP, engl. reversed phase) HPLC-kolonner. Valget af HPLC-kolonne afspejler de fysiske egenskaber for mange af de forbindelser, bioorganisk kemi beskæftiger sig med. I realiteten ville mange inden for den organiske kemi også være veltjent med RP-HPLC-kolonner.
Referencer:
1. K. J. Jensen, J. Alsina, M. F. Songster, J. Vágner, F. Albericio, G. Barany, J. Am. Chem. Soc., 120, 1998, 5441-5452.
2. F. Guillaumie, J. C. Kappel, N. M. Kelly, G. Barany, K. J. Jensen, Tetrahedron Lett., 41, 2000, 6131-6135.
3. U. Boas, J. Brask,J. B. Christensen, K. J. Jensen, J. Comb. Chem., 4, 2002, 223-228.
4. J. Nielsen, Curr. Opin. Chem.Biol. 6, 2002, 297-305.
5. J. A. Olsen, K. J. Jensen, J. Nielsen, J. Comb. Chem., 2, 2000, 143-150.
6. L. Petersen, K. J. Jensen, J. Nielsen, Synthesis, 1999, 1763-1766.
7. J. B. Laursen, P. C. de Visser, H. K. Nielsen, K. J. Jensen, J. Nielsen, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 2002, 171-175.
8. J. B. Laursen, C. B. Jørgensen, J. Nielsen, Bioorg. Med. Chem., 11, 2003, 723-731.
Boks 1
Fastfasesyntese (solid-phase synthesis)
I en fastfasesyntese kobles den første byggesten gennem en linker (se boks 3) til en fastfase (engl. solid phase eller solid support; typisk et resin, dvs. en krydsbundet polymer), hvorefter resten af molekylet opbygges, indtil slutproduktet er klar til at blive frigivet fra resinet. Fordelen er primært, at den kemiske forbindelse under hele syntesen er forankret til en polymer, der kan filtreres, dvs. at overskydende reagenser og biprodukter kan fjernes ved simpel filtrering. Dermed slipper man for at skulle oprense mellemprodukterne efter hvert trin, og man kan nemt bruge reagenser i stort overskud for at forøge graden af omsætning. Når den kemiske forbindelse er syntetiseret, frigøres den fra fastfasen ved selektivt at bryde bindingen fra slutproduktet til linkeren. Det kræver en linker, der er stabil under syntesen, og som siden kan kløves under betingelser, der ikke nedbryder den netop opbyggede kemiske forbindelse.
Fastfasesyntese blev oprindeligt udviklet til fremstillingen af peptider og siden også til oligonucleotider. De seneste år har man overført teknikker kendt fra fastfasesyntesen af biopolymerer til fremstillingen af praktisk taget et hvilket som helst organisk molekyle. Derudover er der udviklet et helt arsenal af nye kemiske metoder og teknikker. Der er imidlertid et stort behov for at udvikle nye resiner, linkere og kemiske reaktioner til fastfasesyntese, idet væskefasereaktioner kun i begrænset omfang kan overføres direkte til fastfasen.
Boks 2
Kombinatorisk kemi
Combinatorial chemistry (engl.), kemiske metoder, hvorved et meget stort antal forskellige stoffer kan fremstilles på en kontrolleret måde og efterfølgende undersøges (screenes) effektivt og fuldautomatisk (HTS, high throughput screening). Kombinatorisk kemi har sin oprindelse i en serie opfindelser og opdagelser i midten af 1980’erne og i begyndelsen af 1990’erne. Metoden er afledt af det matematiske begreb kombinatorik, hvor man studerer mulige anordninger eller kombinationer af et antal genstande. Den samling af kemiske stoffer, der resulterer af kombinatorisk kemi, kaldes kombinatoriske biblioteker og kan enten bestå af rene stoffer eller systematiske blandinger af stoffer. Stofferne er opbygget af molekylfragmenter, der kaldes byggeblokke eller byggesten. Byggestenene A1 til A20 kombineres med byggestenene B1 til B20 til de 400 produkter A1- B1 til A20- B20. Metoden kan automatiseres og er velegnet til opdagelse af nye lægemidler, katalysatorer eller nye materialer.
Boks 3
Linkere (håndtag)
Når man skal planlægge en syntese på fastfase, er de to allerførste spørgsmål, hvordan den første byggeblok skal forankres, dvs. bindes kovalent til fastfasen, og hvordan slutproduktet siden skal frigives. I mange tilfælde (f.eks. i syntesen af de fleste peptider) er syntesen planlagt, så de semipermanente beskyttelsesgrupper på sidekæden fraspaltes samtidig med frigivelsen af slutproduktet, dvs. under identiske kemiske betingelser. I langt de fleste tilfælde forankres den første byggesten til resinet gennem en såkaldt linker. Linkeren er forbindelsesleddet mellen resinet og molekylet, der er under opbygning. Linkeren kan ses som et bifunktionelt molekyle, som i den ene ende tillader permanent forankring til resinet og i den anden ende har karakter af en beskyttelsesgruppe, hvilket tillader semipermanent forankring, der tillader frigivelse af molekylet under så milde kemiske betingelser, at slutproduktet kan fraspaltes i intakt stand. Samtidig skal linkeren være så stabil, at den ikke kløves under opbygningen af molekylet. Linkeren kunne også kaldes et håndtag, da det holder fast i molekylet, indtil det fuldt udbyggede slutprodukt frigives under veldefinerede betingelser. Valget af linker er dermed en central del af den samlede synteseplan. Udviklingen af nye linkere (og betingelser for frigørelsen af slutprodukterne) er et vigtigt område inden for nye fastfasemetoder.
Figur 1. BAL-konceptet til syntese af C-terminalt modificerede peptider.
Figur 2. Trithio-orthoestre som maskerede thioestre i syntesen af peptid-thioestre.
Figur 3: T-BAL-håndtaget.
Figur 4. Hapalosin target-strukturen med angivelse af »strukturelle domæner« og den efterfølgende syntesevej. Den skraverede kugle angiver fastfasen eller polymeren, der var lavet af funktionaliseret polystyren. Templat-molekylet 3-amino-4-hydroxy-5-nitrobenzoesyre blev koblet til BAL-håndtaget ved reduktiv aminering. De efterfølgende trin var i) acylering af carboxylsyregruppen; ii) acylering af anilinfunktionen; iii) reduktion af nitro til anilin; iv) acylering af 2. anilin; v) reduktiv aminering med aldehyd og vi) kløvning af stofferne fra resin.
Figur 5. Saphenic acid og fastfasesyntesen af saphenamycin-analoger. Den skraverede kugle angiver igen fastfasen; en chlorotrityl-funktionaliseret polystyren. Syntesetrinene var i) kobling til tritylresin; ii) acylering af den sekundære benzyliske alkohol; iii) kløvning af stofferne fra resin. I rammen vises strukturen af (R)-saphenamycin.
