Reaktionsoptimering og afdækning af synergimekanismer ved brug af statistisk forsøgsdesign. Resultaterne kan være med til at optimere den industrielle produktion af bioethanol.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2005 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Hanne R. Sørensen1,2, Anne S. Meyer2, Sven Pedersen1
1Novozymes A/S, 2 BioCentrum-DTU
Industriel produktion af bioethanol er i dag enten baseret på direkte gæring af sukkerholdige afgrøder, især sukkerrør, eller på brug af stivelsesholdige substrater som majs og hvede [1]. Den sidstnævnte metode bygger på en enzymkatalyseret nedbrydning af frøhvidens stivelse til glucose og efterfølgende gæring af glucosen til ethanol vha. bagegær Saccharomyces cerevisiae [2]. I Europa bruges der primært hvede til produktion af ethanol til drikkesprit, brændselsethanol og teknisk brug. Udnyttelsen af frøhvidens stivelse og herunder stivelsens enzymatiske nedbrydning til forgærbart glucose er tilnærmelsesvis optimal. En mere fuldstændig udnyttelse af hvedens resterende frøhvide kan imidlertid finde sted, hvis også frøhvidens cellevægges indhold af hemicellulose og cellulose udnyttes. En vigtig forudsætning for gæringen er, at cellevægsmaterialet først omdannes til et forgærbart hydrolysat.
Enzympræparater
På Novozymes A/S arbejder vi sammen med BioCentrum-DTU på enzymkatalyseret hydrolyse af især hvedekorns cellevægge mhp. substratets senere forgæring til ethanol eller andre slutprodukter. En lang række mikroorganismer, primært skimmelsvampe, producerer en vifte af enzymaktiviteter, der helt eller delvist kan katalysere nedbrydning af cellevægspolysaccharider. Novozymes A/S producerer en række enzympræparater. der kan anvendes til hydrolyse af korns cellevægge (tabel 1). De i tabel 1 nævnte enzympræparater er multikomponente enzymer, der både har en hovedaktivitet og sideaktiviteter. Ved udvikling af enzymer er de primære opgaver derfor at indkredse de rette enzymaktiviteter, karakterisere deres hydrolytiske effektivitet samt kortlægge og optimere reaktionsforholdene (f.eks. pH og temperatur).
Frøhvidens cellevægspolysaccharider: Hemicellulose
Cellevæggene i korns frøhvide (endosperm) indeholder både 1®3,1®4-b-D-glucan, glucomannan, cellulose, arabinoxylan, og arabinogalaktan foruden lidt protein. »Hemicellulose«-fraktionen omfatter normalt arabinoxylan, arabinogalaktan og glucomannan, men ofte inkluderes også b-D-glucan. Substitutionsgraden af arabinoxylan og arabinogalaktan varierer markant i forskellige typer korn og formentlig også i deres forskellige typer cellevægge. I endospermcellevæggene i hvede er hemicellulosefraktionen domineret af arabinoxylan, der udgør ca. 70% af cellevægspolysacchariderne [3].
Enzymatisk nedbrydning af arabinoxylan
Som vist i figur 1 består arabinoxylan af en hovedkæde af (1®4)-bundne b-D-xylopyranosylenheder med a-arabinofuranosylsubstituenter bundet enkeltvis til C(O)-3 i xylose eller dobbeltsubstitueret til både C(O)-2,3 i en xylopyranosylenhed (figur 1). Arabinoxylans basale skelet er opbygget af 5-leddede monosaccharider, dvs. pentoser. Derfor omtales arabinoxylan – især i lidt ældre litteratur – ofte som pentosan. Analogt hertil betegnes de enzympræparater, der kan katalysere nedbrydningen af arabinoxylan, ofte som »pentosanaser«. Xyloseenhederne i arabinoxylan kan være substitueret med acetylgrupper, glucuronsyre, eller med 4-O-methyleret glucuronsyre; arabinoseenhederne kan være esterificeret med ferulinsyre eller p-coumarinsyre ved C-5 (ikke vist i figur 1). Arabinoxylan kan således betegnes som et komplekst, substitueret heteropolysaccharid. Ligesom andre polysaccharider kan arabinoxylan nedbrydes til monosaccharider vha. syre eller enzymatisk katalyse. Ved en efterfølgende gæring af hydrolysatet har enzymkatalyseret hydrolyse den fordel, at produktion af forbindelser, der kan hæmme gæringen, minimeres [4]. Pga. arabinoxylans sammensætning kræver den enzymkatalyserede nedbrydning til monosaccharider forskellige aktiviteter, dvs. enzymaktiviteter, der kan katalysere fraspaltningen af sidegrupperne og enzymaktiviteter, der kan katalysere hydrolysen af xylanhovedkæden.
De enkelte typer enzymaktivitet
Det er en grundlæggende antagelse, at den enzymatiske nedbrydning af xylanhovedkæden først finder sted, når en del af arabinosylsidegrupperne er fjernet. Den enzymkatalyserede fraspaltning af sidegrupperne i arabinoxylan kræver, at flere forskellige enzymer kommer i spil. Disse inkluderer: a-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), muligvis også feruloylesterase (EC 3.1.1.73), a-glucuronidase (EC 3.2.1.139) og acetylesterase (EC 3.1.1.6). Betydningen af hver aktivitet afhænger af substratets molekylære sammensætning. Relevante enzymaktiviteter, der kan katalysere depolymeriseringen af xylankæden, inkluderer endo-1,4-b-xylanase (EC 3.2.1.8) og b-xylosidase (EC 3.2.1.37), hvor b-xylosidase frigør xylose fra korte xylankæder (xylo-oligosaccharider). Da arabinoxylan kan være sammenflettet med øvrige plantecellevægspolysaccharider, herunder b-glucan og cellulose, kan andre aktiviteter være påkrævede for at give de arabinoxylannedbrydende aktiviteter adgang til deres substrat. De ekstra enzymer, der er brug for til at løse denne opgave, inkluderer bl.a. cellulase (EC 3.2.1.4), endo-1,3(4)-b-glucanase (EC 3.2.1.6), exo-b-glucosidase (EC 3.2.1.74). Adskillige af de multikomponente enzympræparater, der er kommercielt tilgængelige til brug i forskellige plante- eller cerealieprocesser, forventes at indeholde relevante sideaktiviteter, der helt eller delvist kan katalysere hydrolysen af arabinoxylan (tabel 1). Da produktionen af de kommercielle præparater samtidig er optimeret og fødevaregodkendt, er en evaluering af eksisterende enzympræparaters effektivitet, alene eller i blanding, et naturligt udgangspunkt for identifikation af relevante arabinoxylannedbrydende enzymaktiviteter. For at identificere effektiviteten af de tilstedeværende sideaktiviteter er det dog nødvendigt at anvende relativt høje enzymdoseringer ift. de niveauer enzymer normalt tilsættes i.
Statistisk forsøgsdesign i vurdering af enzymreaktioner
Enzymers aktivitet og stabilitet påvirkes på forskellige måder af reaktionsforholdene, især af temperatur og pH. Forskellige andre faktorer, f.eks. tilstedeværelsen af inhibitorer, kan indvirke på enzymaktiviteten. For at vurdere effektiviteten af en række forskellige enzympræparater og samtidig kortlægge reaktionsparametrenes betydning for enzymernes hydrolytiske effektivitet er en rationel tilgang til forsøgsplanlægning nødvendig.
Netop her har statistisk designede forsøg, bl.a. i forskellige responsfladedesign, været effektive redskaber til hurtigt at evaluere enzympræparaters ydeevne og samtidig kortlægge betydningen af reaktionsparametrene for enzymaktiviteten. Frem for at vurdere indflydelsen af f.eks. enzymdoseringen, reaktionstiden, pH og temperatur ved at variere én parameter ad gangen, designes en række forsøg, hvor forskellige kombinationer af enzymdosering og reaktionsparametre testes på én gang i flere niveauer. Resultatet af hver reaktionskombination sammenlignes derefter med multivariat regression (valget af regressionsmetode afhænger af design). Når mere end to reaktionsparametre skal undersøges i samme forsøgsrække, anskues forsøgsopsætningen i en tredimensional kvadratisk struktur (figur 2a-b). Simple faktorforsøg kan designes på to måder:
i) som et centralt composite design (CCD), hvor midterniveauerne er aksiale punkter, der når uden for selve kvadraten (figur 2a) eller
ii) som en variant af det centrale composite design, såkaldte fladecentrerede CCD, hvor de testede faktorers midterniveauer er rykket ind på kvadratens flader (figur 2b). En deltaljeret gennemgang af forskellige varianter af CCD-designet kan findes i Montgomery [5].
Fordele og begrænsninger
De fladecentrerede design er bedst til at evaluere enzymatisk hydrolyse. Det skyldes bl.a., at det ikke er muligt at tilsætte »negativ« enzymdosering (vil CCD kræve, hvis centerpunktdoseringen ønskes ret lav). Resultaterne, kaldet responserne, analyseres med multivariat regressionsanalyse, og analysen resulterer i den model, der bedst beskriver data. Forsøgsdesignet og målingernes kvalitet påvirker de resulterende modellers validitet. De resulterende modeller kan afbildes på forskellige måder. Den flade, modellen beskriver, kaldes en responsflade. Det er klart, at faktorforsøg ikke kan bruges til at udlede kinetiske konstanter eller til direkte at sammenligne forskellige reaktioners forløb. Men erfaringen viser, at resultaterne af designede responsfladeforsøg hurtigt kan give grundlag for valg af optimale reaktionsparametre til videregående enzymforsøg ved enzymatisk hydrolyse af hvede frøhvide eller andre bioressourcer.
Enzymatisk frigivelse af arabinose og xylose
For at vurdere effektiviteten af sideaktiviteter i forskellige enzympræparater til nedbrydning af arabinoxylan blev der udført et fladecentreret CCD med faktorerne tid, dosis, pH og temperatur (tabel 2). Som indikatorer for nedbrydningseffektiviteten blev arabinose- og xylosefrigivelsen målt. Celluclast 1.5 L og Ultraflo L indeholdt de mest relevante (og bedste) sideaktiviteter: En analyse af de udførte responsfladeforsøg viste, at de to enzympræparater responderede forskelligt på pH: Arabinosefrigivelsen blev bedst katalyseret af Ultraflo L og var højest ved stigende pH med maksimum frigivelse mellem pH 5.5 og pH 6.0 (figur 3a). En detaljeret dataanalyse afslørede, at maksimum var ved pH 5.8. Der var ikke en statistisk signifikant effekt af temperaturen inden for det testede temperaturinterval. Ultraflo L-tilsætning gav kun minimal xylosefrigivelse (data ikke vist). Omvendt gav Celluclast 1.5 L-tilsætning tilnærmelsesvis ingen arabinosefrigivelse (data ikke vist), men katalyserede frigivelsen af noget xylose fra substratet. Frigivelsen af xylose, katalyseret af Celluclast 1.5 L, var gradvist bedre med faldende pH, ned til pH 4.5 (figur 3b). En detaljeret evaluering af data viste, at det optimale pH for xylosefrigivelsen i forsøgsrammen var 4.5. Temperaturen havde ikke nogen signifikant effekt på xylosefrigivelsen inden for det testede temperaturinterval. Faktorforsøgene afslørede derfor to problemer:
1) At frigivelsen af hhv. arabinose og xylose fra arabinoxylan blev katalyseret bedst af to forskellige enzympræparater.
2) At katalysen af hhv. arabinose og xylosefrigivelse var maksimal ved forskelligt pH.
En detaljeret dataanalyse samt en redegørelse for hvilke enzymaktiviteter i de to præparater, der er ansvarlige for at katalysere frigivelsen af hhv. arabinose og xylose, er præsenteret andetsteds [6].
Mixture-design
For at arabinose- og xylosefrigivelsen kan katalyseres i samme reaktion, er det nødvendigt, at flere forskellige enzymreaktioner foregår samtidig. Vi har derfor fundet et kompromis med en kombinationstilsætning af Ultraflo L og Celluclast 1.5 L, som foregår ved pH 5.0 og 50°C. Spørgsmålene er herefter:
1) om tilsætning af endnu et enzympræparat til en blanding af de to præparater kan øge den hydrolytiske effekt og
2) hvilket indbyrdes blandingsforhold, der giver optimalt udbytte.
Ternære mixture-design er velegnede til at besvare begge spørgsmål. Vha. et tertiært diagram kan udbytter ved blanding af tre enzymer/enzympræparater i forskellige forhold sammenlignes. Siden enzympræparatet Finizym 200 L også effektivt kan katalysere frigivelsen af arabinose fra arabinoxylan (data ikke vist) blev Finizym 200 L, Celluclast 1.5 L, og Ultraflo L kombineret i forskellige forhold. Udbyttet af hhv. arabinose og xylose blev bestemt for hvert af disse delforsøg. De opnåede udbytter modelleres som responsflademodeller, de forskellige mixturemodeller, der kan anvendes er beskrevet i Montgomery [6]. Data kan afbildes grafisk som konturplots og kan bruges direkte til at bestemme optimum. I tilfældet arabinose- og xylosefrigivelse fra systematiserede kombinationer af de tre valgte enzympræparater viste de opnåede data, at den optimale arabinosefrigivelse blev katalyseret ved et blandingsforhold på ca. 90:10 Ultraflo L:Celluclast 1.5 L (figur 4a), mens den optimale xylosefrigivelse var ved en ca. 50:50 blanding af Ultraflo L:Celluclast 1.5 L og helt uafhængig af tilstedeværelse af Finizym 200 L (figur 4b).
I dette arbejde, der er en del af et ph.d.-studium, har forskellige statistiske forsøgsdesign vist sig at være effektive til at undersøge og sammenligne individuelle »multikomponente« enzympræparater og systematiske kombinationer af sådanne enzympræparater. Det har også vist sig, at brug af responsfladeforsøg er velegnede til at vurdere nye enzymers effektivitet og robusthed, herunder monokomponente enzymer, dvs. enzympræparater med en enzymaktivitet. Disse data har givet inspiration til en ny enzymdoseringsmetode med sekventiel tilsætning af kommercielle enzympræparater og monokomponente enzymer. Når de mest effektive enzymaktiviteter og reaktionsbetingelser er identificeret, kan det betale sig detaljeret at undersøge og modellere kinetikken.
Referencer:
1. Zaldivar J, Nielsen J, and Olsson L. Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol Biotechnol 56:17-34, 2001
2. Lewis SM. Fermentation alcohol. In: Godfrey T, West S, editors. Industrial enzymology, 2nd ed. London: MacMillan Press Ltd; 1996. p. 11-48.
3. Izydorczyk M, Biliaderis CG, and Bushuk W. Comparison of the structure and compostition of water-soluble pentosans from different wheat varieties. Cereal Chem 68:139-144, 1991
4. Saha BC. a-L-arabinofuranosidases: biochemistry, molecular biology and application in biotechnology. Biotechnol Adv. 18:403-423, 2000.
5. Montgomery DC. Response surface methods and other approaches to process optimization. In: Montgomery DC, editor. Design and analysis of experiments, 5th ed. John Wiley & Sons, Inc; 2001. p. 427-510.
6. Sørensen HR, Meyer AS, and Pedersen S: Enzymatic hydrolysis of water-soluble wheat arabinoxylan. 1. Synergy between a-L-arabinofuranosidases, endoxylanases, and b-xylosidase activities. Biotech Bioeng, 81:726-731, 2003.
Tabel 1. Oversigt over kommercielle enzympræparater, der kan anvendes til at nedbryde cellevægge i korn.
Data og informationer er taget fra Novozymes A/S’ produktdatablade.
Tabel 2. Fladecentreret Centralt Composite Design (CCD) med faktorerne dosis, tid, pH og temperatur, i alt 27 kombinationer.
Figur 1. Udsnit af den basale struktur af arabinoxylan fra hvede.
Figur 2. Centralt composite design (a) samt et fladecentreret central composite design (b). Punktet i midten er centerpunktet. X1, X2 og X3 er akserne i det centrale composite design.
Figur 3. Responseflademodeller for frigivelsen af arabinose (a) og xylose (b) ved enzymatisk hydrolyse af hvedearabinoxylan med hhv. Ultraflo L og Celluclast 1.5 L.
Figur 4. Responseflademodeller af tertiære mixture-design for frigivelsen af arabinose (a) og xylose (b) ved enzymatisk hydrolyse af hvedearabinoxylan med 66 forskellige kombinationer af Ultraflo L, Celluclast 1.5 L og Finizym 200 L i 24 timer. Tallene i cirklerne angiver den enzymatiske hydrolyse i procent. Total hydrolyse = 100%. Enzymdoseringerne er angivet i relativ % af den samlede enzymdosering.
