Vacciner baseret på genetisk materiale kan måske i fremtiden beskytte mod AIDS, hepatitis, malaria og andre livstruende infektioner uden de traditionelle vacciners ulemper og begrænsninger. Imidlertid er det svært at få optaget de genetiske vacciner i kroppen; især når de skal indtages gennem munden.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2001 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af cand.pharm., ph.d.-studerende Annette Vinther Heydenreicha, overlæge Anders Fomsgaardb og professor, ph.d. Henning Gjelstrup Kristensenc
a) og c) Institut for Farmaci, Danmarks Farmaceutiske Højskole, b) Molekylærvirologisk Laboratorium, Statens Serum Institut
Genetiske vacciner har stort potentiale, specielt når det gælder beskyttelse mod virussygdomme som AIDS, herpes, influenza og hepatitis, hvor DNA-vaccinerne får kroppen til at efterligne det immunrespons, som opstår ved virusinfektioner (intracellulære infektioner).
Samtidig er DNA-vacciner yderst attraktive, fordi de ikke medfører nogen infektionsrisiko modsat traditionelle vacciner, der består af svækkede eller døde patogener eller dele deraf. Her er der altid en principiel risiko for, at levende men svækkede mikroorganismer kan mutere til sygdomsfremkaldende former eller kan medføre normal infektion i personer med svækket immunforsvar.
Et af de store mål på internationalt plan er at udvikle en DNA-vaccine mod HIV, som forårsager AIDS. Her vil man foretrække en vaccine, som indgives gennem munden eller via andre slimhinder i kroppen, så tilstedeværelsen af sundhedsfagligt personale ikke er nødvendigt. Desuden vil en immunisering af de relevante slimhinder forventes at producere et forsvar (herunder IgA), som allerede ved optagelsen af virus kan bremse infektionen ved slimhinden. På den måde undgår man, at virus fordeles i hele kroppen (i tilfældet med HIV, angriber immunsystemet).
DNA-vacciner har også den fordel, at DNA er let og billigt at producere, hurtigt kan testes og er mere temperaturstabilt end proteinbaserede vacciner. I fremtiden kan man forestille sig samtidig vaccination for flere sygdomme pga. muligheden for indsætte gener fra en vifte af mikroorganismer i plasmidvektoren. På den måde vil immunforsvaret blive sat i alarmberedskab over flere typer infektioner på én gang. Samme strategi kan anvendes for muterende vira (HIV og influenza).
Princippet i DNA-vacciner
DNA-vacciner består af et plasmid, som koder for et eller flere overfladeproteiner fra den mikroorganisme, som man ønsker beskyttelse imod, f.eks. en virus.
Ved vaccinationen udtrykkes genet bl.a. i antigenproducerende celler, som efterfølgende præsenterer det antigene protein på overfladen. Proteinet sætter nu immunforsvaret i alarmberedskab over for den pågældende virus på samme måde, som en almindelig vaccine gør det. Immunsystemet genkender det producerede virusprotein som fremmed, hvorved et beskyttende immunrespons iværksættes med produktion af antistoffer, CD8+ killer celler, CD4+ helper celler, B og T memory celler samt specifikke cytokiner.
DNA-vaccination aktiverer både det humorale (antistofproduktion) og det cellemedierede (dannelse af cytotoksiske T-celler, CD8+celler) immunsystem. T-celler, som dræber inficerede celler, dannes sjældent ved brug af konventionelle vacciner, men de menes at være essentielle for at skabe en immunisering mod virus som HIV eller ved cancervacciner.
Selvom det er over ti år siden, at princippet bag DNA-vacciner blev beskrevet og fundet værdifuldt, er der endnu ikke markedsført vacciner af denne type. Det skyldes især, at det er vanskeligt at udvælge de immunogene overfladeproteiner fra virus og bakterier, som DNA-vaccinen skal udtrykke, samt at DNA kun i meget ringe grad optages i kroppens celler.
For at opnå en tilstrækkelig intracellulær optagelse må man enten skyde DNA direkte ind i cellerne (gene-gun) eller maskere DNA-vaccinen i tomme virus, polymerer eller liposomer. Endelig giver DNA-vacciner som andre genteknologiske lægemidler anledning til etiske overvejelser, da de principielt set kan blive integreret i arveanlæggene. Ingen af de hidtidige studier har imidlertid vist, at dette sker i praksis.
Svær formulering
Selvom adskillige kliniske studier har vist beskyttende immunitet ved DNA-vaccination, er den intracellulære optagelse i cellerne og i kernen ineffektiv, hvorfor det ofte er nødvendigt at anvende store mængder plasmid, og det på trods af at det antages, at et beskyttende immunrespons kan opnås ved at 100-1000 celler præsenterer de antigene proteiner på deres overflade.
Den lave optagelse i cellerne skyldes især DNA-molekylets fysiske og kemiske egenskaber. Molekylet er stort (ofte 5-10 kbp ~ 3,5-7×106 g/mol) og hydrofil (negativ ladning fra phosphodiesterbindingerne i DNA-skelettet), hvilket ligeledes vanskeliggør passagen over de lipidholdige cellemembraner. Desuden nedbrydes DNA-vaccinen af enzymer (nucleaser), både i blodet og i cellerne, og endelig er det nødvendigt at få transporteret vaccinen hen til de antigene celler.
På trods af intens forskning er udvalget af anvendelige transportsystemer endnu begrænset. Til DNA-vaccination har man hovedsagelig anvendt to metoder. Den første er injektioner i muskler eller under huden med nøgent DNA. Den anden er gen-pistoler, hvor DNA-vaccinen kobles til guldpartikler, som så skydes direkte ind i hudceller (Langerhanske celler).
Det antages, at den intracellulære optagelse hovedsagelig sker ved endocytose, hvor plasmidet indkapsles i vesikler kaldet endosomer. Under optagelsen fusionerer endosomerne med lysosomerne, vesikler med lav pH og høj enzymaktivitet. Derfor bør plasmiderne være beskyttet, så de forlader endosomerne i intakt stand, hvilket kan gøres ved at kompleksbinde og indkapsle plasmiderne i kationiske lipider/polymerer eller tilsætte fusogene stoffer, som kan sprænge lysosomerne inden nedbrydning. Endelig skal plasmiderne/plasmidkomplekset være i stand til at gennembryde kernemembranen. Først når DNA-vaccinen er kommet ind i cellekernen, sker transskriptionen af genet og derefter ekspressionen af antigene proteiner.
Mulig oral DNA-vaccine
Vanskelighederne bliver endnu større, når den genetiske vaccine skal indgives via munden. Her må man også beskytte vaccinen mod enzymatisk nedbrydning i mavetarmkanalen samt i blodet.
På Institut for Farmaci, Danmarks Farmaceutiske Højskole arbejdes der på at udvikle et transportsystem baseret på faste fedtpartikler med en størrelse på 100-300 nanometer. Her kan DNA enten indkapsles i en lipidmatrix eller kompleksbindes på partiklernes overflade. Lipidernes faste form bevirker, at DNA-vaccinen frigives langsomt ved enten diffusion eller erosion, hvorved der både opnås en forlænget afgivelse og en beskyttelse af DNA-vaccinen.
Lipidpartiklerne kan fremstilles af non-toksiske stoffer. Ved at benytte positivt ladede komponenter kan partiklerne fremstilles med en positiv overfladeladning, således at de kan kompleksbinde det negativt ladede DNA, så plasmidet kondenseres på overfladen. Vi ønsker imidlertid ikke ladningsneutralitet af komplekserne, men en positiv nettoladning, som øger partiklernes vekselvirkning med den negativt ladede cellemembran.
Forsøg med mus
Partikler med størrelser mellem 50 nanometer og 5 mikrometer kan passere tarmvæggen i begrænset omfang – jo mindre partikler, i desto højere grad passerer de væggen og optages i blodet. Det sker primært i afgrænsede områder i tarmen Peyer’s Patches, hvor M-cellerne transporterer partikler, bakterier, vira m.v. direkte til antigenpræsenterende celler i det underliggende lymfoide væv, som er en del af lymfesystemet. Ved potente lægemiddelstoffer som DNA-vacciner, der indgives i små mængder, vil denne optagelsesvej kunne anvendes.
Orale immuniseringsforsøg er igangsat på mus for at undersøge, i hvilket omfang antistoffer dannes i slimhinderne (livmoderslimhinden og i endetarmen) og i blodbanen. Såfremt et positivt resultat opnås, vil den cytotoksiske T-celle-produktion mod HIV blive undersøgt. Desuden udføres i øjeblikket in vitro studier i bl.a. dendritiske celler (professionelle antigenpræsenterende celler) med henblik på evaluering af den intracellulære optagelse og ekspression i celler. Senere vil partikeloptagelsen over Peyers Patches i tarmen blive vurderet.
Det langsigtede mål er DNA-vacciner, der kan indgives i tabletform. Men inden dette kan opnås, er det nødvendigt at kende mekanismen for den intracellulære optagelse nærmere samt faktorerne for effektiv beskyttelse af DNA mod enzymerne i mavetarmkanalen.
Mange barrierer i kroppen skal passeres, og mange processer skal styres for at opnå en virksom DNA-vaccine, som kan indtages gennem munden:
1. Nedbrydning i mave-tarmkanalen skal undgås.
2. Vaccinen skal passere over tarmcellerne og komme ud i blodet/lymfen, hvor vaccinen skal beskyttes mod nedbrydning af bl.a. makrofager.
3. Blodet transporterer vaccinen hen til targetcellerne – de antigenpræsenterende celler – i lymfesystemet.
4. Optagelsen af DNA over cellemembranen ind i cellerne sker oftest ved endocytose.
5. Ved optagelsen i cellen indkapsles i endosomer, som under transporten gennem cellen smelter sammen med lysosomerne, der har lav pH og indeholder nedbrydende enzymer. Plasmidet skal frigives til cytoplasma, før det nedbrydes enzymatisk i lysosomerne.
6. Plasmidet bevæger sig hen til cellekernen, hvor det skal være i stand til at trænge ind gennem kernemembranen.
7. DNA-vaccinen transskriberes i nucleus.
8. Derpå produceres det protein fra en virus eller en bakterie, som vaccinen koder for.
9. Endelig frigives intakt protein eller proteinfragmenter (peptider) præsenteres vha. MHC klasse I molekyler på cellens overflade til genkendelse for immunsystemet.
MHC: Major Histocompatibility Complex – molekyler som præsenterer antigener til immunsystemet.
