Grønt fluorescerende protein som sensor for oxidation af proteiner i levende celler Mange proteiner indeholder krydsbindinger, i form af disulfidbroer, mellem forskellige dele af peptidkæden. Nu kan man ved brug af en ny mutant af »Green Fluorescent Protein« måle dannelse af sådanne proteindisulfidbroer direkte i levende celler.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 11, 2003 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Henrik Østergaard og Jakob R. Winther, Fysiologisk Afdeling, Carlsberg Laboratorium
En central forudsætning for funktionen af de fleste proteiner i levende celler er, at de antager en veldefineret tredimensionel struktur. Det sker ved, at aminosyrekæden folder op om sig selv efter et bestemt mønster, der placerer peptidrygraden og sidekæder, så der opnås biologisk aktivitet. Udformningen af den tredimensionelle struktur er dikteret af nonkovalente vekselvirkninger. Derudover er den også ofte holdt på plads af kovalente disulfidbindinger mellem forskellige dele af aminosyrekæden. Disse kan være langt fra hinanden i den primære sekvens (figur 1). Disulfidbindinger eller -broer dannes under oxiderende betingelser ved, at to cysteinrester reagerer med hinanden, hvorved der dannes en binding mellem deres svovlatomer. Reaktionen forløber spontant, om end forholdsvis langsomt, under atmosfæriske iltbetingelser. I mange tilfælde ses det, at sådanne disulfidbroer bidrager væsentligt til at stabilisere proteiner under ufavorable forhold, såsom forøget temperatur eller forskellige kemiske påvirkninger. Et velkendt eksempel på et protein, der indeholder disulfidbroer, er insulin. Det er karakteristisk for proteiner i denne kategori, at de findes uden for cellen eller tilhører cellens sekretoriske apparat. Der findes i cellers sekretoriske apparat et batteri af enzymer, der katalyserer oxidationen af cysteinrester til disulfidbroer, og som sikrer dannelsen af korrekte disulfidbroer. Er der flere end to cysteiner i et protein, vil der ud over den korrekte kombination af cysteiner være flere, som er topologisk uforenelige med den korrekte foldning af aminosyrekæden. Dette undgås med enzymsystemer, der katalyserer omlejringen af disulfidbroer.
Glutations rolle
I modsætning til secernerede proteiner er disulfidbroer stort set fraværende i proteiner, som tilbringer hele deres liv i cellens cytoplasma. Modsvarende det system, der for secernerede proteiner oxiderer cysteiner, findes der i cytoplasma et system, som katalyserer reduktionen af disulfidbindinger – dersom sådanne skulle opstå ved f.eks. oxidativt stress. Et af de vigtige elementer i dette system er det lille cysteinholdige tripeptid g-glutamylcysteinylglycin, også kaldet glutation. Glutation findes i alle væv og i stort set alle organismer i en mængde, som i cellebiologisk sammenhæng er forholdsvis høj, sammenlignelig med f.eks. ATP (1-5 mM). Da glutation (forkortet GSH) indeholder cystein, kan det ved oxidation omdannes til glutationdisulfid (som forkortes GSSG). Ikke overraskende findes der i cytosolen, fordi disulfidbindinger aktivt reduceres, et væsentligt overskud af GSH i forhold til GSSG, mens der uden for cellerne (i f.eks. serum) findes væsentligt mere GSSG. Selvom man i mange år har vidst, at det overordnet set forholdt sig sådan, har det været og er fortsat, uhyre vanskeligt at måle forholdet mellem oxideret og reduceret glutation i celler, navnlig fordi GSH/GSSG-forholdet varierer i forskellige dele af cellen.
Grønt fluorescerende protein
I eukaryote celler sker proteinfoldning og dannelse af disulfidbroer i det endoplasmatiske retikulum (ER) inden proteinerne via vesikeltransport føres videre til celleoverfladen og efterfølgende udskillelse. Vi har i en årrække arbejdet med foldning og oxidation af secernerede proteiner i ER. For at studere mekanismerne for disulfidbrodannelse har vi benyttet bagerigær som modelorganisme og undersøgt, hvordan mutationer i forskellige gener har påvirket foldningen og disulfidbrodannelsen i modelproteiner. De metoder, man har til rådighed, er desværre ret begrænsede, og vi var derfor interesserede i at finde en ny metode til at studere oxidation af cysteiner i proteiner. Vi var især interesserede i at følge graden af disulfiddannelse direkte i levende celler. Vi begyndte at studere et protein fra Aequorea victoria, en vandmand fra den nordlige del af Stillehavet. Det interessante ved dette protein, som går under navnet Green Fluorescent Protein (GFP), er, at det fluorescerer kraftigt. Fluorescensen sker ved så lange lys-bølgelængder, at der sjældent ses interferens fra den fluorescens, man i øvrigt støder på i det meste biologiske væv. Da GFP har en meget kraftig fluorescens, og da man vha. DNA-teknologi kan få de fleste organismer til at producere proteinet, er GFP blevet et af de mest anvendte proteiner inden for molekylær cellebiologi. Vha. fluorescensmikroskopi kan man f.eks. følge dets lokalisering og tilstedeværelse i bestemte væv og inden for bestemte cellulære organeller. Varianter af GFP har været brugt som sensorer for intracellulære calciumniveauer samt pH. Krystalstrukturen af GFP er vist i figur 2. Den består af en regelmæssig tøndeformet 11-strenget b-foldebladsstruktur. Strukturen omgiver en central fluorofor, der er ansvarlig for GFP’s fluorescens-egenskaber. Fluoroforen, som er kovalent bundet til proteinet, dannes i en unik autokatalytisk proces, hvor et segment af peptidkæden i GFP ringsluttes, og et ekstensivt aromatisk system dannes.
Fluorescensen gøres afhængig af
disulfidbrodannelsen
For at etablere et nyt værktøj til studiet af disulfidbrodannelse i levende celler satte vi os for at introducere cysteiner i en gul-fluorescerende variant af GFP kaldet YFP. Vi ønskede at placere cysteinerne, så fluorescensen ville ændre sig afhængigt af, om de var oxideret til en disulfidbro.
Baseret på YFP’s kendte tredimensionelle struktur udvalgte vi aminosyrer på overfladen af proteinet tæt på en bestemt tyrosinrest (Tyr203), som vekselvirker med den centrale fluorofor i YFP. Vha. genteknologi ændrede vi parvis disse aminosyrerester til cystein (de gule og røde kugler i figur 2). Vi forestillede os, at hvis vi kunne vride i β-foldebladsstrukturen på dette sted ved dannelse af en disulfidbro, ville dette efter al sandsynlighed påvirke fluorescensen. Denne antagelse viste sig at holde bedre, end vi havde turdet håbe. Blandt de fire mutanter indeholdende cysteinpar, som vi klonede og fremstillede i colibakterier, var der én, som gav et betragteligt fald i fluorescensintensiteten ved oxidation af cysteinresterne til disulfid [1]. Figur 3 viser fluorescensspektret af den reducerede og oxiderede form af proteinet, som vi kalder rxYFP, for redoxsensitiv YFP. Forholdet mellem fluorescensintensiteten af den reducerede og oxiderede tilstand er 2,2, hvilket er rigeligt til at kunne give præcise biokemiske og cellebiologiske målinger. For at forstå årsagerne til den redoxafhængige fluorescens krystalliserede vi det oprensede rxYFP. Vha. røntgenkrystallografisk strukturanalyse af rxYFP, som blev udført i samarbejde med Annette Henriksen, Carlsberg Laboratorium, fandt vi, at dannelse af disulfidbroen faktisk trækker de to β-strenge, hvori cysteinerne er placeret, tættere sammen (figur 4). Dermed påvirkes placeringen af den nævnte tyrosinrest samt en histidinrest, som hydrogenbinder direkte til fluoroforen.
Bestemmelse af redoxpotentiale
Da vi var interesserede i at bruge vores mutant til at studere intracellulære redoxforhold, var det vigtigt at vide, om den oxiderede form var så stabil, at den rent faktisk kunne måle inden for et relevant område. Hvis stabiliteten var meget høj, var det usandsynligt, at der var betingelser i cellen, hvor den ville være reduceret. Omvendt ville rxYFP heller ikke være særlig nyttig, hvis stabiliteten af den oxiderede form var meget lav, idet proteinet så altid ville findes i reduceret form. Dette er helt analogt til en gammeldags pH-indikator: den må nødvendigvis slå om inden for den del af pH-skalaen, der er relevant for ens prøve. Vi bestemte derfor redoxpotentialet af disulfidbroen og fandt, at den var af en sådan størrelse, at det var sandsynligt, at den kunne bruges til at måle noget relevant i levende celler.
Måling af glutations redoxforhold i levende celler
Da vores udgangspunkt var at måle på disulfid-redoxforhold i gær, introducerede vi derefter rxYFP-genet i vildtypegær og i forskellige gærmutanter, vi ønskede at studere. På den venstre del af figur 5 ses et fluorescensmikroskopisk billede af gærceller, som udtrykker rxYFP i cytosolen. Målet var at undersøge, hvordan mutationer i gener, som påvirkede redoxforhold i cellen på forskellig måde, kunne tænkes at påvirke redoxtilstanden af rxYFP. Med andre ord ville vi måle forholdet mellem oxideret og reduceret rxYFP ved at måle fluorescensen i levende celler. Vi har konstrueret varianter af rxYFP, som dirigeres til ER (figur 5, højre del). Dette arbejde er endnu ikke afsluttet, men vi har fastslået, at rxYFP’s redoxtilstand bestemmes af den intracellulære glutation-redoxstatus. Endvidere sker dette skift præcist inden for det fysiologisk relevante område. Som nævnt ovenfor er glutation en overordentlig vigtig komponent i den cellulære disulfid-redoxmetabolisme, og vi ser frem til at lære meget mere om disse forhold i levende celler. Det interessante er, at vi for første gang er i stand til at måle glutations redoxforhold direkte i levende celler og netop i den cellulære organel, man ønsker at vide noget om.
Referencer:
1. Østergaard et al., EMBO J. 20:5853-62 (2001)
2. Heineman et al. Protein Sci. 5:13-23 (1996)
