Saccharomyces cerevisiae benyttes til industriel produktion af en række vigtige farmaceutiske proteiner. En procesteknologisk ulempe ved denne produktion er gærens forkærlighed for at omdanne sukker til ethanol. En mulig løsning kunne være i stedet at bruge Saccharomyces kluyveri.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2003 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af forskningsadjunkt Kasper Møller og lektor Lisbeth Olsson, Center for Process Biotechnology, BioCentrum-DTU, DTU
Gær, især Saccharomyces cerevisiae, er blandt de mest benyttede industrielle mikroorganismer. Industriel brug af gær omfatter bl.a. produktion af bagegær, brygning af øl og fremstilling af vin, produktion af bioethanol, gærekstrakt, specielle kemikalier, industrielle enzymer samt farmaceutiske proteiner og peptider. Det mest velkendte eksempel på heterolog proteinproduktion i gær er insulin (Novo Nordisk A/S), som produceres af en rekombinant stamme af S. cerevisiae ved kontinuert fermentering.
Gærs sukkermetabolisme afhænger af vækstbetingelserne, og under aerobe betingelser (iltrige forhold) skelnes der mellem:
(i) aerob respiratorisk metabolisme, hvor alt sukker forbrændes ved respiration og der kun dannes biomasse og kuldioxid, og
(ii) aerob fermentativ metabolisme, hvor en del af sukkeret omdannes til ethanol.
S. cerevisiae vil, selv om der er ilt til stede, omsætte det meste af sukkeret til ethanol og kuldioxid (Crabtree-effekten, figur 1) under alle driftsbetingelser. Det gælder dog ikke ved vækst i sukkerbegrænsede fødekontrollerede systemer (kontinuert eller fed-batch), så længe den specifikke sukkerforbrugshastighed er under en bestemt stammeafhængig værdi (den tilsvarende fortyndingshastighed for en kontinuert reaktor kaldes for den kritiske fortyndingshastighed). Det betyder, at ved produktion af heterologe proteiner må der benyttes kontinuerte eller fed-batch fermenteringer, der skal opereres, så der kan opretholdes aerob respiratorisk metabolisme, for at sukkeret omsættes til biomasse og protein og ikke til ethanol.
Fordele ved S. cerevisiae
Der er mange fordele ved at bruge S. cerevisiae til heterolog proteinproduktion. S. cerevisiae er en simpel eukaryot mikroorganisme, og en række proteiner fra højere eukaryoter kræver en eukaryot secernerings-pathway for at opnå biologisk aktivitet. Derudover secernerer (udskiller) S. cerevisiae ikke store mængder af egne proteiner, hvilket betyder, at det secernerede heterologe protein er det primære produkt i gæringsvæsken. S. cerevisiae er også en af de mest velstuderede mikroorganismer, genetiske manipulationer er lette at gennemføre, genomet er fuldt sekventeret og annoteret, og der er en utrolig mængde cellebiologisk information tilgængelig. Desuden kan S. cerevisiae dyrkes til høje cellekoncentrationer på simple medier, og der er en betydelig erfaring med industriel dyrkning af denne gær.
Idéen med dette projekt var at lede efter nært beslægtede gær (så plasmider osv. fra S. cerevisiae kan bruges direkte) med bedre secernerings- og/eller procesteknologiske egenskaber, der som alternativ til S. cerevisiae kan bruges som vært for heterolog proteinproduktion. Her beskrives vores erfaringer med brug af Saccharomyces kluyveri til heterolog proteinproduktion.
Heterolog proteinproduktion med S. kluyveri
Secernering af proteinase A
I de første forsøg med heterolog proteinproduktion i S. kluyveri blev S. cerevisiae proteinase A (PEP4) udtrykt fra et multikopi plasmid i S. kluyveri og S. cerevisiae. Vækst og proteinase A produktion i de rekombinante stammer blev sammenlignet ved batch-fermenteringer (figur 2). Disse forsøg viste, at S. cerevisiae plasmider kunne bruges i S. kluyveri uden problemer, og at aktivt proteinase A blev secerneret til gæringsvæsken. Dette blev også observeret, at udbyttet af biomasse på glucose var væsentligt højere i S. kluyveri (0.27 g biomasse pr. g glucose) end i S. cerevisiae (0.12 g biomasse pr. g glucose), samt at ethanoludbyttet var lavere (0.11 mod 0.40 g ethanol pr. g glucose) [1].
Der er altså en større del af glucosen, som metaboliseres via respiration i S. kluyveri end i S. cerevisiae under batch-fermentering. Dette blev også senere eftervist ved måling af TCA-cyklusaktivitet med 13C-mærket glucose [2]. Mængden af secerneret proteinase A pr. g glucose forbrugt var tre gange højere i S. kluyveri end i S. cerevisiae, mens den specifikke produktivitet (mg protein pr. g biomasse pr. time) var ca. 50% højere [1]. Det var positivt, at der kunne opnås højere udbytte af S. cerevisiae proteinase A fra S. kluyveri end fra S. cerevisiae, og derfor undersøgtes anvendeligheden af S. kluyveri til heterolog proteinproduktion nærmere.
Secernering af a-amylase
Det andet eksempel på heterolog proteinproduktion i S. kluyveri, som blev undersøgt, var secernering af Aspergillus oryzae a-amylase (AMY1). Ekspressionen var under kontrol af promoteren fra S. cerevisiaes actin gen (ACT1), og det native (fra A. oryzae AMY1) secernerings-signal blev benyttet. Vi fandt, at S. kluyveri-transformanterne kunne nedbryde stivelse. Der blev kun detekteret én form af a-amylase i gæringsvæsken, og det var med den forventede størrelse.
For at teste proteinproduktion under industrielt relevante forhold blev en fed-batch fermentering udført. Det var interessant, at undersøge om S. kluyveri kunne dyrkes til høje cellekoncentrationer, samt hvor meget a-amylase der blev produceret (figur 3). Slutkoncentrationen af biomasse var 85 g/L, og a-amylase havde akkumuleret til 320 mg/L (figur 3), hvilket svarer til et udbytte på 3.8 mg a-amylase pr. g dannet biomasse. Til sammenligning giver heterolog proteinproduktion med S. cerevisiae ofte udbytter mellem 0.5 og 5 mg protein pr. g dannet biomasse, men det afhænger fuldstændigt af proteinet, som produceres. Det var således muligt at dyrke S. kluyveri i fed-batch til en høj cellekoncentration, og a-amylase blev produceret med et, for en gær, relativt højt udbytte.
Procesteknologiske overvejelser
Ved industrielle kontinuerte eller fed-batch fermenteringer tilføres sukker som en koncentreret opløsning (150-500 g/L), mens koncentrationen i reaktoren gerne skulle være homogen på et lavt konstant niveau (størrelsesorden 1-200 mg/L) bestemt af driftsbetingelserne og mikroorganismens egenskaber, hvilket stiller store krav til opblandingen i reaktoren [3]. Under industrielle forhold vil der være gradienter i sukkerkoncentrationen, og cellerne vil opleve både lave og høje koncentrationer og skift mellem disse. S. cerevisiae vil efter ganske kort tid i en zone i reaktoren med høj sukkerkoncentration (> ~ 0.5 g/L) producere ethanol og eddikesyre. Det kan specielt give problemer ved fed-batch fermentering, hvor eddikesyre kan akkumulere til toksiske koncentrationer. For at undersøge hvordan S. kluyveri reagerer på sukkergradienter i en bioreaktor, blev en vildtype-stamme dyrket kontinuert med glucose som begrænsende substrat. Fortyndingshastigheden lå, så metabolismen var fuldt respiratorisk, hvorefter en puls af glucose blev tilsat reaktoren. Koncentrationen ændrede sig derved momentant fra ca. 2 mg/L til 10 g/L. Først 40 minutter efter tilsætning af glucose kunne der detekteres ethanol i gæringsvæsken (figur 4). Det var overraskende, da ethanol kan detekteres efter 1-2 minutter i lignende forsøg med S. cerevisiae.
Det viste, at skift i metabolisme pga. sukkergradienter sandsynligvis ikke vil være et problem under industrielle fermenteringer med S. kluyveri.
Ved aerobe glucosebegrænsede kontinuerte fermenteringer med S. kluyveri blev det observeret, at vildtype-stammen har en høj kritisk fortyndingshastighed (omkring 0.50 time-1) [4]. De fleste vildtype-stammer af S. cerevisiae har en kritisk fortyndingshastighed på omkring 0.30 time-1, mens industrielle produktionsstammer pga. proteinproduktionen og optimering af denne ved mutagenese har væsentligt lavere kritiske fortyndingshastigheder (0.10-0.15 time-1). Produktiviteten i aerobe fermenteringsprocesser med gær (og i det hele taget) er begrænset af den maksimale iltoverførsel, der kan opnås i reaktoren, og sjældent af produktionsstammens kritiske fortyndingshastighed. Det er dog muligt at øge iltovergangen ved implementering af nye metoder til at opnå stor masseovergang i eksisterende fermentorer eller nye fermentorkonstruktioner [3], såsom U-loop-fermentorer. En øget iltovergang vil gøre det muligt at øge produktiviteten af heterologe proteiner, men også stille krav til højere kritiske fortyndingshastigheder for produktionsstammerne. Det må forventes, at selv efter mange runder mutagenese vil S. kluyveri have en væsentligt højere kritisk fortyndingshastighed end S. cerevisiae.
De beskrevne forsøg med brug af S. kluyveri til heterolog proteinproduktion har vist, at denne gær secernerer samme mængde eller mere end S. cerevisiae for de to modelproteiner, der er undersøgt. Derudover er S. kluyveri relativt ufølsom over for pludselige ændringer i sukkerkoncentrationen og har en høj kritisk fortyndingshastighed sammenlignet med S. cerevisiae, hvilket gør denne gær til en interessant mikroorganisme ved industriel heterolog proteinproduktion.
Arbejdet blev udført i samarbejde med lektor Jure Piškur og professor Jens Nielsen ved BioCentrum-DTU. STVF har støttet projektet.
Referencer
1. Møller, K., Tidemand, L. D., Winther, J. R., Olsson, L., Piškur, J., and Nielsen, J. 2001. Production of a heterologous proteinase A by Saccharomyces kluyveri. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:216-219.
2. Møller, K., Christensen, B., Förster, J., Piškur, J., Nielsen, J., and Olsson, L. 2002. Aerobic glucose metabolism of Saccharomyces kluyveri: Growth, metabolite production, and quantification of metabolic fluxes. Biotechnol. Bioeng. 77:186-193.
3. Hobley, T. J. 2003. En ny generation af bioreaktorer. Dansk Kemi 3:10-11.
4. Møller, K., Bro, C., Piškur, J., Nielsen, J., and Olsson, L. 2002. Steady-state and transient-state analyses of aerobic fermentation in Saccharomyces kluyveri. FEMS Yeast Res. 2:233-244.
Figur 1. Aerob glucosemetabolisme i S. cerevisiae.
Simpel model for Crabtree-effekten: Så længe den specifikke sukkerforbrugshastighed (blå pil) er under den maksimale respiratoriske kapacitet (rød ring), forbrændes sukkeret ved respiration (aerob respiratorisk metabolisme), men når den specifikke sukkerforbrugshastighed (blå pil) overskrider den maksimale respiratoriske kapacitet (rød ring), dannes der også ethanol (aerob fermentativ metabolisme).
Figur 2. Aerobe batchfermenteringer på glucose med proteinase A (PrA)-producerende gær-stammer.
Øverste graf: S. kluyveri. Nederste graf: S. cerevisiae.
Symboler: glucosekoncentration (○), ethanolkoncentration (D), proteinase A aktivitet (□), cellekoncentrationen er angivet som optisk densitet målt ved 600 nm (◊).
Figur 3. Fed-batch fermentering med S. kluyveri som secernerer a-amylase. Fødemediet indeholdt 500 g/L glucose og blev tilført bioreaktoren med en eksponentielt stigende hastighed, så gærens specifikke væksthastighed var konstant på 0.15 time-1. Oxygenbegrænsning indtraf ved en biomassekoncentration på 53 g/L, hvorefter der blev brugt en konstant fødehastighed. Skiftet fra eksponentiel til konstant fødeprofil er indikeret med en stiplet linje på grafen.
Symboler: proteinkoncentration (x), a-amylaseaktivitet (□), cellekoncentrationen er angivet som optisk densitet målt ved 600 nm (◊).
Figur 4. Glucosepulsforsøg med S. kluyveri. Til tiden t = 0 blev glucosekoncentrationen i bioreaktoren ændret fra 2 mg/L til 10 g/L. Før tilsætning af glucose var metabolismen fuldt respiratorisk.
Symboler: glucosekoncentration (○,●), ethanolkoncentration (D,▲). Fyldte og ikke-fyldte symboler er fra to uafhængige forsøg.
