Ved analyse af blod, urin og andre biologiske væsker er det nødvendigt at bruge meget følsomme og selektive analysemetoder, da prøverne indeholder et stort antal interfererende stoffer, ofte i betragteligt større mængder end analytten. Vha. koblede teknikker kan man studere sporelementers og lægemiddelstoffers omdannelse i biologiske systemer.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 6/7, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Lars Bendahl, , Bente Gammelgaard, Jørgen Olsen, Ole Jøns, Ole Farver, Steen Honoré Hansen, Institut for Analytisk og Farmaceutisk Kemi, DFH
Kapillarelektoforese (CE) er en yderst effektiv mikroseparationsteknik, hvor ladede forbindelser separeres ud fra forskellige migreringshastigheder i et elektrisk felt. Separationerne foregår i bufferfyldte silicakapillarer, typisk med indre diametre på 50 mm i 50 cm længder under indflydelse af spændinger på op til 30 kV. Kapillarernes små dimensioner giver et lavt buffer- (5 mL/analyse) og prøveforbrug (50 nL/analyse). Derfor er følsomheden ikke altid tilstrækkelig til, at teknikken kan bruges ved bioanalyse. To teknikker har ændret dette forhold radikalt. Den første er baseret på en sammenkobling af CE med induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS).
Kobling af CE til ICP-MS
Induktivt koblet plasma-ionisation er en »hård« ionisationsproces, hvor analytterne atomiseres og ioniseres fuldstændigt i 8000°K varmt argonplasma. Når ionkilden kobles til et massespektrometer opnås en elementspecifik detektionsmetode, idet der måles på atomare ioner. Metoden er samtidig meget følsom for en lang række grundstoffer, og man kan måle på enkelte isotoper af et grundstof. Problemet med at koble CE online til ICP-MS ligger i kvantitativt at overføre de separerede prøvekomponenter til plasmaet uden tab af separationseffektivitet. Derfor har vi udviklet et interface til at sammenkoble CE med ICP-MS. Ved tilførsel af en elektrisk ledende opløsning, der omslutter kapillarets udgang og samtidig udgør den elektriske jordforbindelse til kapillarets udgang, forstøves de separerede forbindelser direkte ind i plasmaet [1].
Figur 1 viser et elektroferogram af en testopløsning med fire selenforbindelser i en koncentration på 10 ng/mL. Som en følge af den unikke ionisationsproces opnås der samme responsfaktor (areal) for alle forbindelserne på trods af de strukturelle forskelle. Detektionsgrænserne ligger på ca. 25 fg absolut svarende til en koncentration på ca 1 ng/ml.
Kobling af CE til ESI-MS
Elektrospray-ionisation er en »blød« ionisationsproces, hvor prøven vha. et højt elektrisk felt omdannes til en sky af intakte molekylære ioner. Når ionkilden kobles til et massespektrometer kan man opnå information om et stofs molekylvægt og formodede struktur, samtidig er det en følsom detektionsmetode. Også her er det vigtigt, at så meget som muligt af prøven (fra CE) føres ind i massespektrometret. Det er tidligere muliggjort vha. nanospray-interfaces, hvor der uden brug af ekstra væsketilførsel dannes en meget fin forstøvning af prøven direkte fra analysekapillaret til massespektrometret. Interfacet er kommercielt tilgængeligt, men er relativt kostbart (100.000 kr.). Derfor har vi udviklet et simpelt nanospray-interface, der som de kommercielt tilgængelige gør det muligt at justere kapillarets indstillinger, så elektrosprayen kan rettes direkte mod indgangen til massespektrometret [2]. Spidsen af CE-kapillaret er belagt med nikkel. Laget fungerer som elektrisk jordforbindelse for kapillarelektroforesen og er samtidigt pålagt højspænding til frembringelse af elektrosprayen. Figur 2 viser de ekstraherede ionelektroferogrammer fra en analyse af en 1 mg/mL opløsning af imipramin og tre beslægtede forbindelser. De opnåede detektionsgrænser ligger på 5-100 fg, hvilket svarer til en koncentration på ca. 3-50 ng/mL.
Analyse af selen i human urin
Selen er et essentielt grundstof. Dets biologiske funktion udøves i form af selenoproteiner, hvor vi i dag kender ca. 30 forskellige humane varianter. Alle selenoproteinerne indeholder peptidbundne selenocysteiner, og størstedelen har en antioxidativ funktion. Selen har et meget snævert terapeutisk interval, ved doser lavere end 50 mg/dag opstår der mangelsymptomer, og doser højere end 500 mg/dag er toksiske. Selen har fået øget opmærksomhed efter at en undersøgelse har påpeget at øget selenindtagelse kan have en cancerpræventiv effekt [3]. Kendskabet til selens metabolisme er relativt begrænset, og kun få af de biologisk forekommende selenforbindelser er med sikkerhed identificerede. En af de mest velundersøgte biologiske matricer er urinprøver. Tidligere chromatografiske undersøgelser [4] tyder på, at urinprøver fra personer, der har indtaget selenberiget gær, bl.a. indeholder selenomethionin. Da selenkoncentrationen i urinprøver er meget lav (typisk mindre end 50 ng/mL), og da prøvematricen samtidig er yderst kompliceret, er direkte strukturopklaring vha. ESI-MS vanskelig. Derfor baseres identifikationen af selenspecies i biologiske prøver ofte på baggrund af co-eluering med standarder af kendt struktur ved brug af elementspecifik ICP-MS-detektion. Identifikationen er i sig selv meget usikker, men tilordningen af forbindelsernes identitet kan sandsynliggøres ved at medtage separationsprincipper med en anden selektivitet.
Figur 3 viser en analyse af en urinprøve fra en person, der i tre uger har indtaget 100 mg selen/dag. Det kunne eftervises, at en af forbindelserne co-migrerede med selenomethionin, når urinprøven blev tilsat en standardopløsning. Dvs. at selenomethionin sandsynligvis er en af de mange selenholdige forbindelser, der kan optræde i urin.
Analyse af kosttilskud med selenberiget gær
Selens rapporterede cancerpræventive effekt blev observeret hos forsøgspersoner, der indtog selen i form af selenberiget gær. Forsøgspersonerne fik selen i højere doser, end hvad der var nødvendigt for at maksimere aktiviteten af kendte selenoproteiner. Derfor formodes selens gavnlige effekt at skyldes lavmolekylære, evt. methylerede selenforbindelser fra selengæren. Selenberiget gær dyrkes i et medium, der indeholder selenit i høje koncentrationer og som omsættes til organiske selenforbindelser af gærcellernes enzymsystemer. Til at identificere ukendte selenforbindelser i selenberiget gær bruger mange forskningsgrupper chromatografiske separationsmetoder koblet til ICP-MS.
Kapillarelektroforesens høje separationseffektivitet og anderledes selektivitet gør den velegnet til analyse af selenberiget gær. Figur 4 øverst viser en analyse af et vandigt ekstrakt fra et kosttilskudspræparat, der indeholder 100 mg selen i form af selenberiget gær. Mere end 15 selenforbindelser blev separerede på 13 minutter, og to af forbindelserne co-migrerede med hhv. selenomethionin og selenocystin, da ekstraktet blev tilsat de rene standarder. Begge forbindelser er tidligere påvist i selenberiget gær vha. omvendt fasechromatografi koblet til ICP-MS [5]. Samme forfattere har vist, at selenomethioninandelen blev større, når ekstrakten behandledes med proteolytiske enzymer. For at frigøre peptidbundne aminosyrer hydrolyseredes ekstraktet med 6 M saltsyre ved 110°C i 24 timer. Figur 4 nederst viser, at næsten alle de oprindelige selenforbindelser ved syrebehandlingen blev nedbrudt til en forbindelse, der co-migrerede med selenomethionin. Derudover blev der dannet to nye forbindelser, som co-migrerede med hhv. trimethylselenonium og methylselenomethionin. Resultaterne understøtter tidligere chromatografiske undersøgelser og viser, at CE-ICP-MS er en lovende teknik for hurtige og effektive separationer af de selenspecies, der forekommer i selenberiget gær.
Analyse af bromhexinmetabolitter i humane urinprøver
For at få tilladelse til at sælge et lægemiddel skal man have kendskab til, hvad der sker med lægemiddelstoffet, efter det er optaget i kroppen. Sædvanligvis omsættes lægemiddelstoffet i større eller mindre grad i bl.a. leveren, og et kendskab til arten af de dannede produkter og deres udskillelse fra kroppen giver bl.a. en sikkerhed for produktets uskadelighed. Mange lægemiddelstoffer indeholder grundstoffer, der kan kvantiseres med ICP-MS-detektion, eksempelvis metaller, halogener, svovl og phosphor. Dette muliggør humane metabolismestudier af lægemidler, der indeholder stabile isotoper.
Lægemiddelstoffet bromhexin, der anvendes i hostesaft, indeholder to bromatomer og undergår typisk fase 1 og fase 2 metabolismereaktioner, der fører til en række hydroxylerede og N-demethylerede derivater samt glucoronsyrekonjugater, som udskilles via urinen.
Figur 5 viser to elektroferogrammer af en human urinprøve fra en forsøgsperson, der tre gange dagligt har indtaget fire bromhexintabletter svarende til i alt 96 mg bromhexin.
Ved direkte analyse af urinprøven efter 1:1 fortynding med CE-bufferen (øverst) er det muligt at detektere en hovedmetabolit, en række mindre forekommende metabolitter (indsat) samt en mindre mængde uomdannet lægemiddel. Efter en selektiv fastfase-ekstraktionsprocedure, der opkoncentrerede prøven otte gange, opnåedes der basislinjeseparation af otte bromhexinmetabolitter inden for en analysetid på 7 minutter (nederst). For at opnå information om metabolitternes identitet analyseredes prøven fra fastfase-ekstraktionen vha. CE-MS. Figur 6 viser et ekstraheret ionelektroferogram for en af de metabolitter, der kunne detekteres i prøven. Indsat i figuren ses forbindelsens formodede struktur og massespektrum, der viser det karakteristiske isotopmønster, som forventes for en forbindelse, der indeholder to bromatomer. Da elektrospray-ionisationen er følsom over for matrixeffekter (ion suppression), kunne de øvrige omdannelsesprodukter først detekteres efter en mere selektiv prøvetilberedning [6].
Ved at kombinere resultater fra CE-ICP-MS og CE-MS(MS) er det muligt at få både kvalitativ og kvantitativ information om et lægemiddels omdannelsesprodukter uden brug af autentiske standarder eller radioaktivt mærkede forbindelser. Yderligere er prøveforbruget ved CE typisk i størrelsen 1-50 nL, hvilket er fordelagtigt i udviklingen af lægemidler.
Referencer:
1. L. Bendahl, B. Gammelgaard, O. Farver, O. Jøns and S. H. Hansen, J. Anal. Atom. Spectrom., 2001, 16(1), 38
2. L. Bendahl, J. Olsen, B. Gammelgaard, S. H. Hansen, O. Jøns, O. Farver, manuskript under udarbejdelse.
3. L. C. Clark, G. F. Combs, B. W. Turnbull, E. H. Slate, D. C. Chalker, J. Chow, L. S. Davis, R. A. Glover, G. F. Graham, E. G. Gross, A. Krongrad, J. L. Lesher, H. K. Park, B. B. Sanders, C. L. Smith and J. R. Taylor, J. Am. Med. Assoc, 1996, 276, 1957.
4. B. Gammelgaard, O. Jøns, L. Bendahl, J. Anal. Atom. Spectrom., 2001, 16(4), 339
5. S. M. Bird, P. C. Uden, J. F. Tyson, E. Block and E. Denoyer, J. Anal. Atom. Spectrom., 1997, 12(7), 785
6. S. H. Hansen, L. Bendahl, B. Gammelgaard, O. Jøns, O. Farver, Acceptered i Chromatographia.
Figur 1. CE-ICP-MS-analyse af fire vandige selenstandarder, hver i en koncentration på 10 ng Se/mL.
Figur 2. CE-ESI-MS-analyse af imipramin og tre derivater, hver i en koncentration på 1 mg/mL. De fire øverste figurer viser de ekstraherede ionelektroferogrammer samt forbindelsernes struktur, og nederst vises summen af de ekstraherede elektroferogrammer.
Figur 3. CE-ICP-MS-analyse af human urinprøve fra en person, der i tre uger har indtaget 100 mg selen/dag.
Figur 4. (Øverst) CE-ICP-MS-analyse af et vandigt ekstrakt fra et selenholdigt kosttilskudspræparat, der indeholder selenberiget gær før og (nederst) efter hydrolyse med 6 M saltsyre.
Figur 5. CE-ICP-MS-analyse af urinprøve fra en person, der har indtaget 96 mg bromhexin før og efter opkoncentrering (nederst).
Figur 6. Ekstraheret ionelektroferogram fra CE-ESI-MS-analyse af en urinprøve fra en person, der har indtaget 96 mg bromhexin.
Boks 1. Strukturer af selenforbindelser.
flg. 3 billedtekster kan bruges, hvis vi vælger at bruge et eller flere af vedlagte 3 billeder
Skematisk illustration af plasma-ionisationsprocessen.
Skematisk illustration af CE-ICP-MS-koblingen.
CE-MS-interfacet monteret på et Finnigan LC-Q ion-trap massespektrometer.
