Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 4, 2021 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger her.
Sammenkoblet HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR til hurtig identifikation af bioaktive naturstoffer i komplekse blandinger.
Af professor Dan Stærk, Naturstofkemisk Forskningsgruppe, Institut for Lægemiddeldesign og Farmakologi, Københavns Universitet
Hvis du deltager i Jeopardy og får svaret: “Højtopløselig inhibitions-profilering i kombination med HPLC-PDA-HRMS-SPE-ttNMR”, så skal du stille spørgsmålet: “Hvad er den ultimative sammenkoblede analytisk-skala teknologi, der hurtigt og effektivt kan pinpointe og strukturopklare nye bioaktive naturstoffer i komplekse ekstrakter?”. Det lyder måske som et fjernt fremtidsscenarie, men er ikke desto mindre allerede nu en veludviklet teknologi, der tillader fuld strukturopklaring af komplekse bioaktive naturstoffer direkte fra analytisk-skala HPLC-analyse af komplekse råekstrakter.
Naturen er en rig kilde til bioaktive organiske molekyler, hvilket blandt andet ses ved, at naturstoffer og analoger heraf udgør op mod 70 procent af al medicin inden for visse sygdomsområder [1]. Klassiske og velkendte eksempler på bioaktive naturstoffer er morfin fra opiumsvalmuer (Papaver somniferum), artemisinin fra en Kinesisk bynke (Artemisia annua) og penicillin fra skimmelsvampe (Penicillium spp.) – men der registreres stadig mange nye lægemidler baseret på naturstoffer [1]. Planter og svampe er derfor lovende kilder til nye bioaktive stoffer, og i fremtiden forventes eksempelvis marine organismer og fødevarerestprodukter at blive vigtige klimavenlige kilder til bioaktive stoffer (figur 1).
Ekstrakter af ovennævnte er imidlertid så komplekse, at isolering og strukturopklaring af de aktive indholdsstoffer svarer til at lede efter en nål i en høstak. Således er det ikke usædvanligt, at et råekstrakt af en medicinplante indeholder mere end 100 forskellige stoffer i meget forskellig mængde og i grupper af nært beslægtede analoger, der er svære at adskille. Samtidig er det vigtigt at undgå at analysere allerede kendte stoffer og/eller stoffer, der ikke er bioaktive. I naturstofkemisk forskningsgruppe ved Københavns Universitet har vi udviklet, hvad der i vores øjne er den ultimative sammenkoblede analytiske teknologi til sådanne undersøgelser: højt-opløselig inhibitions profilering/HPLC-PDA-HRMS-SPE-ttNMR. Se faktabokse for forklaring af forkortelser og figur 2 for en skematisk illustration.
Med denne sammenkoblede teknologi får man via én og samme platform i) et biokromatogram, der direkte pinpointer de indholdsstoffer, der er korreleret med bioaktivitet, ii) UV og HRMS-data til dereplikering (det vil sige identifikation af allerede kendte stoffer) og iii) 1D og 2D NMR-spektre til fuld strukturopklaring af nye naturstoffer. Analysen kan således ses som en tretrinsraket, hvor hver proces er vigtig for at løfte den næste:
Første trin i processen starter efter endt udvikling af en analytisk-skala HPLC-metode med tilfredsstillende separation af så mange indholdsstoffer som muligt. HPLC-eluatet mikrofraktioneres i korte konstante tidsintervaller i en eller flere 96-brønds plader. Eluatet fordampes og bioaktiviteten mod det valgte enzym- eller cellulære assay bestemmes. Herefter omregnes resultaterne til procent inhibition og indsættes som funktion af retentionstiderne for de enkelte brønde. Dette resulterer i en højt-opløselig inhibitionsprofil, i daglig tale et biokromatogram, som effektivt tillader lokalisering af de HPLC-peaks, hvor materialet er korreleret med bioaktivitet. Mikrofraktioneringen kan gentages og fraktionerne testes for andre bioaktiviteter. I naturstofkemisk forskningsgruppe laver vi rutinemæssigt polyfarmakologiske biokromatogrammer [2-4]. Den fortsatte kemiske analyse kan derefter målrettes de bioaktive stoffer.
I næste trin foretages en dereplikering baseret på de UV- og HRMS-data, som systemet også genererer. Dereplikering er terminologien for den proces, hvor kendte stoffer identificeres, og i et naturstofkemisk drug discovery-projekt er det en vigtig del af processen for ikke at spilde tid på isolering og strukturopklaring af kendte stoffer, som blot kunne købes hos et kemikaliefirma. Dereplikering kan ske ved at sammenligne lmax og UV-spektre fra PDA-analysen samt bruttoformler for hovedioner og fragmenter fra HRMS-analysen med interne og/eller eksterne databaser. Nyligt er det også inden for naturstoffer blevet muligt med en mere automatiseret dereplikering via Global Natural Products Molecular networking [5], som baserer sig på maskinlæring og kunstig intelligens til at matche eksperimentelle data fra tandem massespektrometri med tilsvarende data i databaser eller gennem generering af teoretiske data ud fra en foreslået struktur.
Det sidste trin omfatter isolering og strukturopklaring af de potentielt nye og bioaktive naturstoffer. Klassisk set er dette sket ved hjælp af præparativ-skala HPLC eller kolonne kromatografi, og har krævet separat metodeudvikling og store mængder ekstrakt og solvent. Men med udvikling af et automatiseret online SPE-system og NMR cryoprober med øget følsomhed, kan dette nu ske direkte fra analytisk-skala HPLC uden yderligere metodeudvikling. Således bruges UV- og/eller HRMS-baserede kromatogrammer fra HPLC-PDA-HRMS-delen af apparaturet til automatisk “opsamling” af de udvalgte analytter på små SPE-kolonner i to racks med 96 SPE-kolonner i hver. Analytterne adsorberes (trappes) på SPE-kolonnerne, fordi den eluotrope styrke af eluatet sænkes ved at blande det med vand efter PDA-detektoren (post-column dilution). For at øge mængden af adsorberet materiale på SPE-kolonnerne gentages separationerne 10-15 gange, hvor de enkelte analytter adsorberes kumulativt på de samme SPE-kolonner. Efter endt trapping af analytterne fra de gentagne injektioner, tørres SPE-kolonnerne med nitrogengas for at fjerne de ikke-deutererede solventer (typisk vand og acetonitril), da disse vil give forstyrrende signaler i NMR-spektrene. Analytterne på de tørrede SPE-kolonner overføres herefter til 1,7-mm NMR-rør ved at eluere SPE-kolonnerne baglæns med et deutereret NMR-solvent. Hele processen med trapping, tørring og eluering af analytter sker automatisk med et integreret online SPE-enhed, og både SPE-kolonner, NMR- rør og NMR autosampleren benytter sig af 96-rack formatet.
Bioaktive indholdsstoffer i hvid morbær
Hvid morbær (Morus alba) bruges som et traditionelt antidiabetisk naturlægemiddel i flere kulturer. Et ethylacetat ekstrakt af rodbark af hvid morbær blev derfor testet for hæmmende virkning mod enzymerne a-glucosidase, a-amylase og protein tyrosin phosphatase 1B samt for antioxidativ aktivitet med henblik på at finde bioaktive indholdsstoffer med mulig antidiabetisk potentiale. HPLC-kromatogrammet samt de fire biokromatogrammer af ethylacetat ekstraktet ses i figur 3. Der ses, at nogle HPLC-peaks er korreleret med peaks i alle fire biokromatogrammer, hvorimod andre HPLC-peaks kun er korreleret med en peak i ét biokromatogram. HPLC-PDA-HRMS-baseret dereplikering viste, at ekstraktet indeholdt en række kendte såvel som nye stoffer biosyntetiseret via en Diels-Alder reaktion mellem prenylerede chalconer og dehydroprenylphenoler [5]. Disse oplysninger blev brugt til at målrette den efterfølgende HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR-analyse mod indholdsstoffer korreleret med bioaktivitet og/eller nye naturstoffer. Dette førte til isolering og strukturopklaring af 18 naturstoffer ved hjælp af UV, HRMS samt 1D og 2D NMR-eksperimenter direkte fra analytisk-skala HPLC. Et par af de komplekse naturstoffer ses i figur 3.
Fremtidig udvikling
Metodeudvikling, generering af biokromatogrammer og HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR-analyse, inklusive optagelse af 2D NMR-spektre for 10-15 stoffer, vil lægge beslag på et par ugers apparaturtid. Det er imidlertid selve strukturopklaringen af de nye komplekse naturstoffer, som er den tidsbegrænsende faktor. Det skyldes, at denne proces, på trods af udvikling af computer-assisteret strukturopklaring, stadig er forholdsvis håndholdt og kræver en erfaren forsker. Ligeledes tillader strukturopklaringen fra HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR-analyser kun tilordning af den relative stereokemi. I fremtiden vil vi derfor arbejde på yderligere direkte eller indirekte kobling med kiroptiske metoder til bestemmelse af den absolutte stereokemi af isolerede stoffer samt bedre integration af maskinlæring til hel eller delvis automatiseret strukturopklaring ud fra 1D og 2D NMR-spektre.
E-mail:
Dan Stærk: ds@sund.ku.dk
Referencer
1. Newman, D.J.; Cragg, G.M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J. Nat. Prod. 2020, 83, 770-803.
2. Wubshet, S.G.; Tahtah, Y.; Heskes, A.M.; Kongstad, K.T.; Pateraki, I.; Hamberger, B.; Møller, B.L.; Staerk, D. Identification of PTP1B and a-glucosidase inhibitory serrulatanes from Eremophila spp. by combined use of dual high-resolution PTP1B and a -glucosidase inhibition profiling and HPLC-HRMS-SPE-NMR. J. Nat. Prod. 2016, 79, 1063-1072.
3. Tahtah,Y.; Kongstad, K.T.; Wubshet, S.G.; Nyberg,N.T.; Jønsson,L.H.; Jäger,A.K.; Qinglei,S.; Staerk, D. Triple aldose reductase/a-glucosidase/radical scavenging high-resolution profiling combined with high-performance liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry – solid-phase extraction – nuclear magnetic resonance spectroscopy for identification of antidiabetic constituents in crude extract of Radix Scutellariae. J. Chromatogr. A 2015, 1408, 125-132.
4. Zhao, Y.; Kongstad, K. T.; Jäger, A. K.; Nielsen, J.; Staerk, D. Quadruple high-resolution a-glucosidase/a-amylase/PTP1B/radical scavenging profiling combined with high-performance liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry – solid-phase extraction – nuclear magnetic resonance spectroscopy for identification of antidiabetic constituents in crude root bark of Morus alba L. J. Chromatogr. A. 2018, 1556, 55-63.
5. Wang, M.; Carver, J.J.; Phelan, J.V.; Sanchez, L.M.; Garg, N.; Peng, Y.; Nguyen, D.D. et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnol. 2016, 34, 828.
Den opklarende faktaboks
De termer og forkortelser, der er brugt i denne artikel om HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR fremgår nedenfor:
• Bioaktivitet: Termen for stoffer, der har en biologisk eller farmakologisk aktivitet, oftest undersøgt i enzym- eller celle-baserede assays.
• Biokromatogram: Det farmakologiske modstykke til HPLC kromatogrammet, dvs. et kromatogram, som viser indholdsstoffernes farmakologiske aktivitet.
• HPLC: High-performance liquid chromatography eller på dansk højtydende væskekromatografi.
• PDA: Photodiode array detection eller på dansk ofte blot diode array detektion (DAD).
• HRMS: High-resolution mass spectrometry eller på dansk højtopløselig massespektrometri.
• SPE: Solid-phase extraction eller på dansk fastfase ekstraktion. Er oftest brugt til prøveoprensning før kemiske analyser, men bruges i vores eksperimentelle setup efter analytisk-skala HPLC-analyse.
• tt: tube transfer. Den proces, hvor analytter på SPE-kolonner elueres til 1,7 mm NMR-rør.
• NMR: Nuclear magnetic resonance eller kernemagnetisk resonans spektroskopi. NMR er den absolut vigtigste spektroskopiske teknik til strukturopklaring af komplekse organiske forbindelser.
• 1D: Et-dimensionelt, refererer til et NMR-spektrum, hvor der på x-aksen typisk vil være frekvens (kemisk skift) og hvor der på y-aksen vil være intensitet.
• 2D: To-dimensionelt, refererer til NMR-spektroskopi, hvor der er to frekvensakser og data plottes i rummet.
Den nørdede faktaboks
Det beskrevne HPLC-PDA-HRMS-SPE-ttNMR-system består af følgende sammenkoblede enheder:
• Et Agilent analytisk-skala HPLC-PDA-system som via en passiv splitter efter HPLC-kolonnen fører cirka 1% af eluatet til HRMS-detektion og 99% til PDA-detektion.
• Et Bruker MicrOTOF-Q II elektrospray ioniserings quadrupole time-of-flight massespektrometer med høj opløsning for både hovedioner og fragmenter (ved MS/MS-analyser).
• En Knauer post-column pumpe som via et T-stykke fortynder eluatet 1:2.
• En Spark Holland Prospekt II SPE-enhed, som kan opsamle op til 192 analytter på små 10 x 2 mm i.d. SPE-kolonner, som typisk indeholder en poly(styren-divinyl benzen) resin eller C18-materiale.
• En Gilson “tube transfer” autosampler som via en 1-mm nål fylder 1,7-mm NMR-rør i 96-rørs racks. De anvendte rør fyldes med 30 mL, som svarer til volumen af de anvendte SPE-kolonner.
• Et 600 MHz Bruker NMR-instrument med en 1,7-mm TCI (triple-resonance cold inverse) helium-kølet cryoprobe med en SampleJet autosampler med plads til fem 96-rørs racks. Den inverse konfiguration og det aktive volumen på 30 mL giver proben en meget høj massefølsomhed.
