• Facebook
  • Instagram
  • KONTAKT
  • ANNONCERING
  • OM KEMIFOKUS
  • PARTNERLOGIN

KemiFOKUS

Fokus på kemi

  • Analytisk kemi
  • Arbejdsmiljø/Indeklima
  • Bioteknologi
  • Branchenyt
  • Energi
  • Fødevarekemi
  • Historisk kemi
  • Kemiteknik
  • Kemometri
  • Klima og miljø
  • Lovgivning og patenter
  • Medicinalkemi
  • Nanoteknologi
  • Organisk kemi
  • Link til Klimateknologi

Analytisk kemi28. 08. 2021 | heidit

Jagten på bioaktive naturstoffer

Analytisk kemi28. 08. 2021 By heidit

Læs originalartiklen her

Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 4, 2021 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger her.

Sammenkoblet HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR til hurtig identifikation af bioaktive naturstoffer i komplekse blandinger.

Af professor Dan Stærk, Naturstofkemisk Forskningsgruppe, Institut for Lægemiddeldesign og Farmakologi, Københavns Universitet

Hvis du deltager i Jeopardy og får svaret: “Højtopløselig inhibitions-profilering i kombination med HPLC-PDA-HRMS-SPE-ttNMR”, så skal du stille spørgsmålet: “Hvad er den ultimative sammenkoblede analytisk-skala teknologi, der hurtigt og effektivt kan pinpointe og strukturopklare nye bioaktive naturstoffer i komplekse ekstrakter?”. Det lyder måske som et fjernt fremtidsscenarie, men er ikke desto mindre allerede nu en veludviklet teknologi, der tillader fuld strukturopklaring af komplekse bioaktive naturstoffer direkte fra analytisk-skala HPLC-analyse af komplekse råekstrakter.
Naturen er en rig kilde til bioaktive organiske molekyler, hvilket blandt andet ses ved, at naturstoffer og analoger heraf udgør op mod 70 procent af al medicin inden for visse sygdomsområder [1]. Klassiske og velkendte eksempler på bioaktive naturstoffer er morfin fra opiumsvalmuer (Papaver somniferum), artemisinin fra en Kinesisk bynke (Artemisia annua) og penicillin fra skimmelsvampe (Penicillium spp.) – men der registreres stadig mange nye lægemidler baseret på naturstoffer [1]. Planter og svampe er derfor lovende kilder til nye bioaktive stoffer, og i fremtiden forventes eksempelvis marine organismer og fødevarerestprodukter at blive vigtige klimavenlige kilder til bioaktive stoffer (figur 1).
Ekstrakter af ovennævnte er imidlertid så komplekse, at isolering og strukturopklaring af de aktive indholdsstoffer svarer til at lede efter en nål i en høstak. Således er det ikke usædvanligt, at et råekstrakt af en medicinplante indeholder mere end 100 forskellige stoffer i meget forskellig mængde og i grupper af nært beslægtede analoger, der er svære at adskille. Samtidig er det vigtigt at undgå at analysere allerede kendte stoffer og/eller stoffer, der ikke er bioaktive. I naturstofkemisk forskningsgruppe ved Københavns Universitet har vi udviklet, hvad der i vores øjne er den ultimative sammenkoblede analytiske teknologi til sådanne undersøgelser: højt-opløselig inhibitions profilering/HPLC-PDA-HRMS-SPE-ttNMR. Se faktabokse for forklaring af forkortelser og figur 2 for en skematisk illustration.
Med denne sammenkoblede teknologi får man via én og samme platform i) et biokromatogram, der direkte pinpointer de indholdsstoffer, der er korreleret med bioaktivitet, ii) UV og HRMS-data til dereplikering (det vil sige identifikation af allerede kendte stoffer) og iii) 1D og 2D NMR-spektre til fuld strukturopklaring af nye naturstoffer. Analysen kan således ses som en tretrinsraket, hvor hver proces er vigtig for at løfte den næste:

Første trin i processen starter efter endt udvikling af en analytisk-skala HPLC-metode med tilfredsstillende separation af så mange indholdsstoffer som muligt. HPLC-eluatet mikrofraktioneres i korte konstante tidsintervaller i en eller flere 96-brønds plader. Eluatet fordampes og bioaktiviteten mod det valgte enzym- eller cellulære assay bestemmes. Herefter omregnes resultaterne til procent inhibition og indsættes som funktion af retentionstiderne for de enkelte brønde. Dette resulterer i en højt-opløselig inhibitionsprofil, i daglig tale et biokromatogram, som effektivt tillader lokalisering af de HPLC-peaks, hvor materialet er korreleret med bioaktivitet. Mikrofraktioneringen kan gentages og fraktionerne testes for andre bioaktiviteter. I naturstofkemisk forskningsgruppe laver vi rutinemæssigt polyfarmakologiske biokromatogrammer [2-4]. Den fortsatte kemiske analyse kan derefter målrettes de bioaktive stoffer.

I næste trin foretages en dereplikering baseret på de UV- og HRMS-data, som systemet også genererer. Dereplikering er terminologien for den proces, hvor kendte stoffer identificeres, og i et naturstofkemisk drug discovery-projekt er det en vigtig del af processen for ikke at spilde tid på isolering og strukturopklaring af kendte stoffer, som blot kunne købes hos et kemikaliefirma. Dereplikering kan ske ved at sammenligne lmax og UV-spektre fra PDA-analysen samt bruttoformler for hovedioner og fragmenter fra HRMS-analysen med interne og/eller eksterne databaser. Nyligt er det også inden for naturstoffer blevet muligt med en mere automatiseret dereplikering via Global Natural Products Molecular networking [5], som baserer sig på maskinlæring og kunstig intelligens til at matche eksperimentelle data fra tandem massespektrometri med tilsvarende data i databaser eller gennem generering af teoretiske data ud fra en foreslået struktur.

Det sidste trin omfatter isolering og strukturopklaring af de potentielt nye og bioaktive naturstoffer. Klassisk set er dette sket ved hjælp af præparativ-skala HPLC eller kolonne kromatografi, og har krævet separat metodeudvikling og store mængder ekstrakt og solvent. Men med udvikling af et automatiseret online SPE-system og NMR cryoprober med øget følsomhed, kan dette nu ske direkte fra analytisk-skala HPLC uden yderligere metodeudvikling. Således bruges UV- og/eller HRMS-baserede kromatogrammer fra HPLC-PDA-HRMS-delen af apparaturet til automatisk “opsamling” af de udvalgte analytter på små SPE-kolonner i to racks med 96 SPE-kolonner i hver. Analytterne adsorberes (trappes) på SPE-kolonnerne, fordi den eluotrope styrke af eluatet sænkes ved at blande det med vand efter PDA-detektoren (post-column dilution). For at øge mængden af adsorberet materiale på SPE-kolonnerne gentages separationerne 10-15 gange, hvor de enkelte analytter adsorberes kumulativt på de samme SPE-kolonner. Efter endt trapping af analytterne fra de gentagne injektioner, tørres SPE-kolonnerne med nitrogengas for at fjerne de ikke-deutererede solventer (typisk vand og acetonitril), da disse vil give forstyrrende signaler i NMR-spektrene. Analytterne på de tørrede SPE-kolonner overføres herefter til 1,7-mm NMR-rør ved at eluere SPE-kolonnerne baglæns med et deutereret NMR-solvent. Hele processen med trapping, tørring og eluering af analytter sker automatisk med et integreret online SPE-enhed, og både SPE-kolonner, NMR- rør og NMR autosampleren benytter sig af 96-rack formatet.

Bioaktive indholdsstoffer i hvid morbær
Hvid morbær (Morus alba) bruges som et traditionelt antidiabetisk naturlægemiddel i flere kulturer. Et ethylacetat ekstrakt af rodbark af hvid morbær blev derfor testet for hæmmende virkning mod enzymerne a-glucosidase, a-amylase og protein tyrosin phosphatase 1B samt for antioxidativ aktivitet med henblik på at finde bioaktive indholdsstoffer med mulig antidiabetisk potentiale. HPLC-kromatogrammet samt de fire biokromatogrammer af ethylacetat ekstraktet ses i figur 3. Der ses, at nogle HPLC-peaks er korreleret med peaks i alle fire biokromatogrammer, hvorimod andre HPLC-peaks kun er korreleret med en peak i ét biokromatogram. HPLC-PDA-HRMS-baseret dereplikering viste, at ekstraktet indeholdt en række kendte såvel som nye stoffer biosyntetiseret via en Diels-Alder reaktion mellem prenylerede chalconer og dehydroprenylphenoler [5]. Disse oplysninger blev brugt til at målrette den efterfølgende HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR-analyse mod indholdsstoffer korreleret med bioaktivitet og/eller nye naturstoffer. Dette førte til isolering og strukturopklaring af 18 naturstoffer ved hjælp af UV, HRMS samt 1D og 2D NMR-eksperimenter direkte fra analytisk-skala HPLC. Et par af de komplekse naturstoffer ses i figur 3.

Fremtidig udvikling
Metodeudvikling, generering af biokromatogrammer og HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR-analyse, inklusive optagelse af 2D NMR-spektre for 10-15 stoffer, vil lægge beslag på et par ugers apparaturtid. Det er imidlertid selve strukturopklaringen af de nye komplekse naturstoffer, som er den tidsbegrænsende faktor. Det skyldes, at denne proces, på trods af udvikling af computer-assisteret strukturopklaring, stadig er forholdsvis håndholdt og kræver en erfaren forsker. Ligeledes tillader strukturopklaringen fra HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR-analyser kun tilordning af den relative stereokemi. I fremtiden vil vi derfor arbejde på yderligere direkte eller indirekte kobling med kiroptiske metoder til bestemmelse af den absolutte stereokemi af isolerede stoffer samt bedre integration af maskinlæring til hel eller delvis automatiseret strukturopklaring ud fra 1D og 2D NMR-spektre.

E-mail:
Dan Stærk: ds@sund.ku.dk

Referencer
1. Newman, D.J.; Cragg, G.M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J. Nat. Prod. 2020, 83, 770-803.
2. Wubshet, S.G.; Tahtah, Y.; Heskes, A.M.; Kongstad, K.T.; Pateraki, I.; Hamberger, B.; Møller, B.L.; Staerk, D. Identification of PTP1B and a-glucosidase inhibitory serrulatanes from Eremophila spp. by combined use of dual high-resolution PTP1B and a -glucosidase inhibition profiling and HPLC-HRMS-SPE-NMR. J. Nat. Prod. 2016, 79, 1063-1072.
3. Tahtah,Y.; Kongstad, K.T.; Wubshet, S.G.; Nyberg,N.T.; Jønsson,L.H.; Jäger,A.K.; Qinglei,S.; Staerk, D. Triple aldose reductase/a-glucosidase/radical scavenging high-resolution profiling combined with high-performance liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry – solid-phase extraction – nuclear magnetic resonance spectroscopy for identification of antidiabetic constituents in crude extract of Radix Scutellariae. J. Chromatogr. A 2015, 1408, 125-132.
4. Zhao, Y.; Kongstad, K. T.; Jäger, A. K.; Nielsen, J.; Staerk, D. Quadruple high-resolution a-glucosidase/a-amylase/PTP1B/radical scavenging profiling combined with high-performance liquid chromatography – high-resolution mass spectrometry – solid-phase extraction – nuclear magnetic resonance spectroscopy for identification of antidiabetic constituents in crude root bark of Morus alba L. J. Chromatogr. A. 2018, 1556, 55-63.
5. Wang, M.; Carver, J.J.; Phelan, J.V.; Sanchez, L.M.; Garg, N.; Peng, Y.; Nguyen, D.D. et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnol. 2016, 34, 828.

Den opklarende faktaboks
De termer og forkortelser, der er brugt i denne artikel om HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR fremgår nedenfor:
• Bioaktivitet: Termen for stoffer, der har en biologisk eller farmakologisk aktivitet, oftest undersøgt i enzym- eller celle-baserede assays.
• Biokromatogram: Det farmakologiske modstykke til HPLC kromatogrammet, dvs. et kromatogram, som viser indholdsstoffernes farmakologiske aktivitet.
• HPLC: High-performance liquid chromatography eller på dansk højtydende væskekromatografi.
• PDA: Photodiode array detection eller på dansk ofte blot diode array detektion (DAD).
• HRMS: High-resolution mass spectrometry eller på dansk højtopløselig massespektrometri.
• SPE: Solid-phase extraction eller på dansk fastfase ekstraktion. Er oftest brugt til prøveoprensning før kemiske analyser, men bruges i vores eksperimentelle setup efter analytisk-skala HPLC-analyse.
• tt: tube transfer. Den proces, hvor analytter på SPE-kolonner elueres til 1,7 mm NMR-rør.
• NMR: Nuclear magnetic resonance eller kernemagnetisk resonans spektroskopi. NMR er den absolut vigtigste spektroskopiske teknik til strukturopklaring af komplekse organiske forbindelser.
• 1D: Et-dimensionelt, refererer til et NMR-spektrum, hvor der på x-aksen typisk vil være frekvens (kemisk skift) og hvor der på y-aksen vil være intensitet.
• 2D: To-dimensionelt, refererer til NMR-spektroskopi, hvor der er to frekvensakser og data plottes i rummet.

Den nørdede faktaboks
Det beskrevne HPLC-PDA-HRMS-SPE-ttNMR-system består af følgende sammenkoblede enheder:
• Et Agilent analytisk-skala HPLC-PDA-system som via en passiv splitter efter HPLC-kolonnen fører cirka 1% af eluatet til HRMS-detektion og 99% til PDA-detektion.
• Et Bruker MicrOTOF-Q II elektrospray ioniserings quadrupole time-of-flight massespektrometer med høj opløsning for både hovedioner og fragmenter (ved MS/MS-analyser).
• En Knauer post-column pumpe som via et T-stykke fortynder eluatet 1:2.
• En Spark Holland Prospekt II SPE-enhed, som kan opsamle op til 192 analytter på små 10 x 2 mm i.d. SPE-kolonner, som typisk indeholder en poly(styren-divinyl benzen) resin eller C18-materiale.
• En Gilson “tube transfer” autosampler som via en 1-mm nål fylder 1,7-mm NMR-rør i 96-rørs racks. De anvendte rør fyldes med 30 mL, som svarer til volumen af de anvendte SPE-kolonner.
• Et 600 MHz Bruker NMR-instrument med en 1,7-mm TCI (triple-resonance cold inverse) helium-kølet cryoprobe med en SampleJet autosampler med plads til fem 96-rørs racks. Den inverse konfiguration og det aktive volumen på 30 mL giver proben en meget høj massefølsomhed.

Skrevet i: Analytisk kemi

 
 

Seneste nyt fra redaktionen

Højere hastigheden og mindre kompleksiteten skal sikre den europæiske konkurrenceevne

AktueltBranchenyt27. 03. 2023

Skal man koge det ned til ganske få ord, vil EU have mindre bøvl omkring sagsbehandlingerne. Det stod klat efter EU’s stats- og regeringschefer blev enige om, at man vil gøre reguleringen mere enkel og sagsbehandlingen i EU, mens hastigheden for sagsbehandlingen skal op i de enkelte

Dansk-tysk aftale er første skridt på vejen til en brintrørledning på tværs af grænsen

Energi24. 03. 2023

Brint og Power-to-X er set som værende en af de helt store teknologier i en mere grøn fremtid med vedvarende energi. For at det skal lykkedes, skal man have opbygget en infrastruktur, der kan håndtere fx brinten. Og det nu er første skridt taget til en fremtidig brintrørledning mellem Danmark og

Prisvindende gymnasielærer er fanatisk omkring STEM-fagene på den positive måde

BranchenytTop24. 03. 2023

Man forbinder det sjældent med noget godt, når folk er fanatiske, men i tilfældet med gymnasielærer Klaus Møller Kristensen fra Tradium Teknisk Gymnasium i Randers forholder det sig anderledes. For selv om han betegner sig som fanatisk omkring STM-fagene, er det på en så positiv måde, at han har

Pas på ramløgens giftige familiemedlemmer – de kan i værste fald være dødelige

AktueltMedicinalkemi23. 03. 2023

Med forårets komme er den populære urt ramsløg ved at titte frem i de danske skove. Og der er intet forgjort ved at tilsætte den til sin mad. Men man skal passe på, for den velsmagende urt har en giftig fætter - eller to. Den mest kendte er liljekonval. Planten indeholder en række toxiner, men

Hestebønner

Så er det lykkedes – afkodning af det gigantiske hestebønnegenom er gennemført

FødevarekemiKlima og miljøTop17. 03. 2023

Den proteinrige hestebønne anses for at have en lovende fremtid som fødevare. Den største udfordring hidtil har været, at hestebønnegenomet er så stort og komplekst, at det ikke har været muligt at karakterisere det. Det største kromosom i hestebønnegenomet svarer til hele det humane genom. Uden

Danmark er en blød mellemvare på ranglisten over kvindelige opfindere

AktueltBranchenyt17. 03. 2023

En europæiske liste over patentansøgninger viser det tydeligt. Danske opfindelser er udtænkt af mænd. Kun ved én ud af ti danske patentansøgninger står en kvinde bag, og det gør Danmark i bedste fald en blød mellemvare på det område. Det lave antal kvindelige opfindere i forhold til antal mænd,

Pulje med midler til grøn bioraffinering er blevet løbet over ende

AktueltBioteknologi17. 03. 2023

Interessen for at komme i gang med bioraffinering er stor. Så stor, at en pulje, der har midler som kan støtte op om udviklingen af teknologien, er blevet løbet over ende. Puljen rummer 5 mio. kr. til uddeling i 2022, 2023 og 2024, og i år har Landbrugsstyrelsen modtaget ansøgninger om tilskud

Bedre forståelse af den græske Ouzo-effekt kan på sigt føre til bedre emulsioner

KemiteknikMedicinalkemi17. 03. 2023

Nogle kalder drikken Ouzo for Grækenland på flaske, men den anissmagende græske brændevin, der er landets nationaldrik, gemmer også på en hemmelighed, der på sigt kan føre til bedre emulsioner. Normalt er Ouzo en klar væske, men når den blandes med vand forvandles den til en mælkehvid opløsning.

Lettere adgang til supercomputere rummer store perspektiver for dansk forskningsmiljø

Branchenyt16. 03. 2023

Bedre medicin, klimaoptimeret byggeri og mere viden om fjerne galakser. Mulighederne er store, når man har den massive regnekraft fra supercomputere til rådighed. Og dem får forskere nu lettere adgang til takket være DeiC Integration Portal. Bag initiativet til den nye portal står The Danish

Hvordan fungerer en LED-lyskilde?

Energi16. 03. 2023

LED-lys har i de seneste år taget verden med storm og har vundet popularitet som en energieffektiv, holdbar og alsidig form for belysning. Men hvad er kemien bag LED-lys? LED (Light Emitting Diode) fungerer ved hjælp af en halvleder, der er placeret mellem to ledende materialer. Når en elektrisk

Tilmeld Nyhedsbrev

Tilmeld dig til dit online branchemagasin/avis





Få fuld adgang til indlægning af egne pressemeddelelser...
Læs mere her

/Nyheder

  • DENIOS ApS

    Sådan sparer du rengøringen efter vedligeholdelsesarbejde

  • Busch Vakuumteknik A/S

    Sikker køling af salat takket være vakuumteknologi

  • Metrohm Nordic

    Kom med på IC-kursus med Metrohm!

  • MD Scientific

    Shodex polymer-baserede HPLC kolonner – se det nye katalog

  • Mikrolab Aarhus A/S

    Kom til Mikrolab Seminardag d. 25 april!

  • Kem-En-Tec Nordic

    ANB Sensors går i partnerskab med Kem-En-Tec Nordic A/S i distributionen af nye, revolutionerende pH sensorer i Danmark, Sverige, Norge og Finland

  • DENIOS ApS

    Øg sikkerheden ved dit opsamlingskar med tre små justeringer

  • Busch Vakuumteknik A/S

    Vakuum bevarer den gode smag

  • Metrohm Nordic

    NIRS DS2500 Analyzers – til polymerer, petrokemi, kemikalier, pharma, palmeolie, produkter til personlig pleje m.m.

  • DENIOS ApS

    35 krav du ikke må misse, når du opbevarer gasflasker udendørs

Vis alle nyheder fra vores FOKUSpartnere ›

Seneste Nyheder

  • Højere hastigheden og mindre kompleksiteten skal sikre den europæiske konkurrenceevne

    27.03.2023

  • Dansk-tysk aftale er første skridt på vejen til en brintrørledning på tværs af grænsen

    24.03.2023

  • Prisvindende gymnasielærer er fanatisk omkring STEM-fagene på den positive måde

    24.03.2023

  • Pas på ramløgens giftige familiemedlemmer – de kan i værste fald være dødelige

    23.03.2023

  • Så er det lykkedes – afkodning af det gigantiske hestebønnegenom er gennemført

    17.03.2023

  • Danmark er en blød mellemvare på ranglisten over kvindelige opfindere

    17.03.2023

  • Pulje med midler til grøn bioraffinering er blevet løbet over ende

    17.03.2023

  • Bedre forståelse af den græske Ouzo-effekt kan på sigt føre til bedre emulsioner

    17.03.2023

  • Lettere adgang til supercomputere rummer store perspektiver for dansk forskningsmiljø

    16.03.2023

  • Hvordan fungerer en LED-lyskilde?

    16.03.2023

  • Danske forskere på vej med en løsning til at fjerne og nedbryde PFAS i ét trin

    15.03.2023

  • Millionbevillig til patentvoucherordning skal give flere blod på tanden

    15.03.2023

  • Minister vil teste for næsten dobbelt så mange PFAS-stoffer i drikkevandet

    15.03.2023

  • Nyt sekventeringsudstyr til SDU efter million-bevilling fra A.P. Møller Fonden

    15.03.2023

  • Den er god nok – gigtramte kan godt forudsige omskift i vejret

    14.03.2023

Alle nyheder ›

Læs Dansk Kemi online

Annoncering i Dansk Kemi

KONTAKT

TechMedia A/S
Naverland 35
DK - 2600 Glostrup
www.techmedia.dk
Telefon: +45 43 24 26 28
E-mail: info@techmedia.dk
Privatlivspolitik
Cookiepolitik