Det er et af de spørgsmål, der ligger bag et forskningsprojekt, der skal udvikle nye enzymatiske teknologier til »food structure engineering«.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 11, 2004 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Charlotte L. Steffensen, Afdeling for Råvarekvalitet, Danmarks JordbrugsForskning
Proteiner bidrager til de strukturelle egenskaber i mange fødevarer. Derfor kan kontrolleret modifikation af proteiner potentielt erstatte visse tilsætningsstoffer til optimering af funktionalitet eller sensorisk opfattelse af fødevarer. Det kan f.eks. være i forbindelse med fremstilling af produkter med et lavt fedtindhold.
Én måde at modificere proteiner på er at skabe krydsbindinger mellem proteiner vha. enzymer. Men, før disse krydsbindende enzymer kan udnyttes i levnedsmidler (på en kontrolleret måde), er det nødvendigt at skaffe sig en basal forståelse af de reaktioner enzymerne katalyserer. Det betyder, at man først må finde ud af, hvordan mekanismerne bag de enzymatisk inducerede krydsbindinger i proteiner kan klarlægges.
Peptider bruges som proteinmodeller
I reaktioner, der katalyseres af oxidative enzymer, vil der indgå et intermediært radikal. Hvis radikalet sidder på et molekyle, der har en størrelse, hvor det frit kan rotere i opløsningen, kan strukturen af dette radikal undersøges ved elektron spin resonance (ESR). Det er én grund til at bruge små peptider som modeller for proteiner. En anden vigtig grund er, at peptiderne er tilpas små til, at en krydsbinding mellem to peptider kan detekteres som en fordobling af massen, vha. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectroscopy (MALDI-TOF MS). I det viste eksempel er tripeptidet GLY (figur 1) brugt som substrat for modelenzymet peberrod peroxidase (horse raddish peroxidase; HRP).
Placeringen af intermediære radikaler bestemmes ved ESR
De intermediære radikaler, der dannes, når peptider bruges som substrat for Peberrod peroxidase, er pga. deres høje reaktivitet kortlivede. For at stabilisere de dannede radikaler tilsættes en spinfanger, der reagerer med radikalerne og danner stabile spinaddukter, som kan måles med ESR. Reaktionsskema er vist i figur 2.
I en reaktionsblanding med 3 mM GLY, 20 mM af spinfangeren MNP og 0.3 mg/ml HRP, der aktiveres ved tilsætning af 1 mM hydrogenperoxid, detekteres et 13 linjers ESR-spektrum (figur 3). Ud fra linjerne kan signalets hyperfin-splitninger bestemmes. Hyperfin-splitninger fortæller, hvilke og hvor mange atomer med spin der befinder sig »tæt på« den frie elektron i radikalet og kan derfor fortælle, hvor i molekylet radikalet er placeret. I dette tilfælde kobler den uparrede elektron til et N-atom (fra spinfangeren) og til 2 gange 2 ækvivalente H-atomer. Det svarer til et tyrosylradikal, der er blevet fanget af spinfangeren på et tidspunkt, hvor den uparrede elektron var placeret på γC af tyrosin (figur 4).
Krydsbinding påvises med MS
Til MS benyttes en reaktionsblanding, der indeholder 3 mM GLY, og HRP immobiliseret på sephadex beads. Reaktionen startes ved at tilsætte 1 mM hydrogenperoxid. I det optagne MS-spektrum (figur 5), kan dannelsen af peptidpolymerer med masser tæt på et multiplum af tripeptidmassen ses.
Udledning af mulige reaktionsmekanismer
Ud fra beregninger af teoretiske masser for peptidpolymerer ses det, at hver krydsbinding er opstået ved en nettoelimination af to hydrogenatomer. Samtidig viste ESR, at reaktionen gik gennem et tyrosylintermediat. Derfor er den oplagte hypotese, at to peptider kan bindes sammen enten ved en reaktion mellem to tyrosylradikaler eller ved en kædereaktion, hvor et tyrosylradikal bindes til et peptid, hvorefter det nye krydsbundne produkt, der stadig indeholder et radikal, kan reagere videre med endnu et peptid.
Det er muligt, at de dannede krydsbindinger er dityrosin- eller isodityrosinbindinger. De to bindingstyper er vist i figur 6. Det fremkomne reaktionsprodukt kan nu bestemmes yderligere ved at analysere for tilstedeværelse af hhv. dityrosin- og etherbindinger.
Enzymatisk krydsbinding i proteiner
Når en HRP-katalyseret krydsbindingsreaktion kan foregå på et peptid, der indeholder tyrosin, antages det, at en lignende reaktion kan finde sted mellem proteiner, der har tilgængelige tyrosiner.
Mekanismer bag enzyminduceret krydsbinding kan klarlægges
Som det ses, er ESR og MS nyttige metoder til at studere enzymkatalyserede krydsbindinger mellem peptider. Der arbejdes for tiden videre på at undersøge, om de identificerede mekanismer kan overføres direkte til proteiner. De beskrevne metoder skal benyttes til at undersøge krydsbindingsmekanismer for andre enzymer; peroxidaser, tyrosinaser og laccaser, der kunne være mere relevante end modelenzymet HRP til brug i forskellige levnedsmidler. Senere er det planen at korrelere de fundne molekylære ændringer med påvirkning af proteinrige fødevarers makromolekylære og funktionelle egenskaber. Herefter kan enzymerne benyttes målrettet i forbindelse med forarbejdning af mejeri-, kød- og kornprodukter.
Flere informationer om projektet, der er en del af EU projektet CROSSENZ, kan findes på http://crossenz.vtt.fi
Figur 1. Et af de modelpeptider, der bruges som substrat for forskellige enzymer, er tripeptidet Glycine-Leusine-Tyrosine (GLY).
Figur 2. Kortlivede radikaler kan detekteres indirekte som spinaddukter. Spinfangeren t-nitroso-butan (MNP) kan reagere med radikaler og danne stabile nitroxylradikaler. I ESR-spektre af MNP-nitroxylradikalet ses opsplitning i en triplet pga. hyperfin kobling mellem den uparrede elektron og N-atomet. Desuden ses opsplitninger, der skyldes atomer i det spinfangede radikal.
Figur 3. ESR-spektrum af et spinaddukt, dannet mellem et peptidradikal og spinfangeren MNP.
En simulering af spektret er lavet ud fra hyperfin-splitningerne: aN = 13.3 G, 2aH = 2.5 G og 2aH = 2.4 G.
Figur 4. Reaktion mellem spinfangeren t-nitroso-butan (MNP) og et tyrosylradikal. MNP har her fanget tyrosylradikalet, da den uparrede elektron var placeret på γC.
Figur 5. Massespektrum af peptidpolymerer dannet ved HRP-katalyseret krydsbinding af tripeptidet GLY.
Figur 6. Eksempler på bindinger der kan danne peptidpolymerer ud fra tyrosinholdige peptider.
(a) 2,2’-dityrosinbinding (b) isodityrosinbinding.
