Liposomer er små vesikler, bestående af et dobbeltlag af fosfolipider, som omslutter et vandigt hulrum. I farmaceutisk forskning anvendes liposomer som model for biologiske membraner og som drug delivery-systemer. Kapillarelektroforese er velegnet til at opnå indsigt i lægemiddelstoffers vekselvirkninger med liposomer.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 8, 2008 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Jesper Østergaard, Ulrik Franzen, Eva H. Møller, Lene Jørgensen, Claus Larsen & Henrik Jensen, Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet
Liposomer har i årevis været genstand for stor interesse i de farmaceutiske og biologiske videnskaber. Det skyldes især liposomers lighed med cellemembraner og deres anvendelse i drug delivery-systemer, hvor modificerede liposomer kan bidrage til transport af lægemiddelstoffer hen til det ønskede virkningssted i kroppen.
Navnet liposom oprinder af betegnelsen ”fedt legeme”, men der er snarere tale om en hul struktur opbygget af fosfolipider. På grund af fosfolipidernes særlige struktur har de tendens til at danne dobbeltlag i vandige opløsninger. Her vender fosfolipidernes hydrofile dele udad mod den vandige fase, mens de lipofile dele samles i dobbeltlagets midte (Figur 1).
Liposomer kan bestå af et eller flere lipiddobbeltlag adskilt af vandfyldte hulrum. Alkylkæderne i fosfolipiderne er typisk 14 til 18 kulstofatomer lange, og diameteren på unilamellære liposomer med kun ét dobbeltlag kan variere i størrelsesordenen 20 nm til 1 μm [1]. Liposomer med forskellig størrelse, ladning og membranpermeabilitet kan fremstilles afhængigt af valget af lipidsammensætning.
Liposomer som lægemiddeltransportører
Lægemiddelstoffer kan indkapsles i liposomernes vandige hulrum, indbygges i lipidmembranen eller adsorberes til liposomets overflade (Figur 1). Lægemiddelstoffets placering vil primært afhænge af dets fysisk-kemiske egenskaber; primært lipofilitet, ladning, størrelse og grænsefladeaktivitet. Når lægemiddelstoffer er lejret i hulrummet, frigives de typisk ved, at liposomet nedbrydes på virkningsstedet i kroppen. Desuden kan forbindelser, som er omsluttet af liposomets membran, undslippe ved diffusion over lipiddobbeltlaget. Hastigheden for frigivelsen er afhængig af lægemiddelstoffets egenskaber og i særdeleshed af membranens rigiditet, som igen afhænger af den anvendte fosfolipidsammensætning.
Liposomernes evne til at transportere lægemiddelstoffer gør dem til et interessant udgangspunkt for lægemiddelformuleringer. Liposomer kan indgives intravenøst, intramuskulært eller oralt, og de kan anvendes med henblik på at reducere et lægemiddelstofs toksicitet, øge dets optagelse i kroppen eller forlænge virkningen via en langsom og kontrolleret frigivelse af det aktive stof fra liposomet. Der findes i dag flere markedsførte lægemidler baseret på liposomteknologi; eksempelvis med indholdsstofferne daunorubicin, doxorubicin, amphotericin B og cytarabin [2].
Model for membraner
Liposomers lighed med biologiske membraner (cellemembraner) har gjort dem til meget anvendte modelsystemer i farmaceutisk forskning [3, 4]. Fordelingskoefficienten er en hyppigt anvendt parameter i forbindelse med forudsigelse af et lægemiddelstofs transport over fx tarmvæg og hud samt lægemiddelstoffers distribution i kroppen.
Fordelingskoefficienter udtrykkes traditionelt via lægemiddelstoffets fordeling mellem n-oktanol og vand, hvilket i dag er alment accepteret som referencesystem og bruges som en skala for lægemiddelstoffers lipofilitet. Imidlertid er der indikationer på, at bedre korrelationer kan opnås i liposomsystemer. Lægemiddelstoffers evne til at trænge over et liposoms lipidmembran og deres fordeling i en liposomholdig opløsning mellem lipidfasen og den vandige fase ved ligevægt kan derfor også bruges til at forudsige lægemiddelstoffers mulighed for at trænge gennem huden og tarmvæggen samt deres tendens til at blive indlejret i fedtvæv [3]. Hvis et lægemiddelstof har meget ringe evne til passere liposomernes lipidmembraner – og dermed cellemembraner og barrierer i organismen – vil stoffets mulighed for at komme ind i kroppen og efterfølgende nå sit virkningssted være meget ringe. Relativt simple forsøg med liposomer kan således hjælpe med til at evaluere nye potentielle lægemiddelstoffers chance for at blive til et færdigt lægemiddel.
Karakterisering af vekselvirkninger ved CE og EKC
En lang række analytiske værktøjer, omfattende fx ligevægtsdialyse, potentiometrisk titrering, mikrokalorimetri, fluorescensspektroskopi og NMR, er nødvendige for at kunne karakterisere liposomer, lægemiddelstof-liposomvekselvirkninger og liposombaserede drug delivery-systemer. Separationsbaserede metoder har fået en stadig større rolle i forbindelse med karakterisering af liposomers vekselvirkninger [5, 6]. På Institut for Farmaci og Analytisk Kemi (Det Farmaceutiske Fakultet, Københavns Universitet) har vi gennem længere tid arbejdet med elektrodrevne separationsmetoder til karakterisering af lægemiddelstoffers interaktioner. Kapillarelektroforese (CE) er en analytisk-kemisk teknik, som traditionelt anvendes til at separere komplekse blandinger baseret på indholdsstoffernes ladning og størrelse. Metoden er relativt hurtig og kræver meget små prøvemængder. Disse egenskaber, sammenholdt med at separationer i CE ikke beror på en stationærfase, gør CE til et attraktivt format til undersøgelse af lægemiddelstof-liposomvekselvirkninger.
Grundlæggende er der beskrevet to formater i forbindelse med analyt-liposomvekselvirkninger ved CE: elektrokinetiskkromatografi og præligevægts-CE udført i frontalanalyse opsætning. Liposom-elektrokinetiskkromatografi (EKC) [6, 7], som er anvendt i de fleste liposomstudier er analogt til micellar- og mikroemulsionselektrokinetiskkromatografi [8]. Ved EKC er liposomerne suspenderet i separationsbufferen. Efter injektion af prøve samt påsætning af spænding over kapillaret vil analytterne vandre gennem kapillaret, hvor de vil tilbringe en del af tiden i bufferfasen henholdsvis i liposomfasen.
Liposomerne, som bevæger sig gennem kapillaret med en hastighed forskellig fra bufferfasen, vil have samme funktion som den stationære fase i HPLC og kaldes derfor for den pseudo-stationære fase. Separation af analytterne sker således både på baggrund af deres migrering i bufferfasen og forskellig fordeling til liposomfasen. Ændring i analytternes migreringstid (elektroforetisk mobilitet), som følge af tilsætning af liposomer til CE bufferen, udnyttes til at detektere og kvantificere fordeling til (vekselvirkning med) liposomfasen.
Ud fra disse mobilitetsændringer kan retentionsfaktoren – og med kendskab til fasevolumenforholdet også fordelingskoefficienten bestemmes under passende betingelser. Liposom-EKC er velegnet til karakterisering af svage vekselvirkninger på grund af den høje separationseffektivitet i CE og EKC. En ulempe forbundet med at have liposomerne suspenderet i separationsbufferen er et dårligt signal-støjforhold, idet liposomerne afhængigt af deres størrelse i større eller mindre grad vil sprede det indsendte UV-lys.
Frontalanalyse-CE
Frontalanalyse-CE [9-11] er grundlæggende forskellig fra EKC-formatet, idet separationsbufferen ikke indeholder liposom og analyt (lægemiddelstof). Prøven indeholder til gengæld begge de interagerende specier, samt efter opnåelse af ligevægt, lægemiddelstof associeret med liposomfasen. Ved introduktion af et passende stort prøvevolumen iagttages ”plateau”-toppe som vist i elektroferogrammerne i Figur 2 i stedet for de sædvanlige karakteristiske smalle og skarpe toppe.
Det relativt store prøvevolumen, 20 – 100 nL, afhængigt af kapillardimensionerne, medfører, at bindingsligevægten opretholdes under separationen af frit lægemiddelstof fra liposomzonen. For en detaljeret gennemgang af frontalanalyse-CE princippet henvises til [10, 11]. Resultatet af et frontalanalyse-forsøg ses i Figur 2: Højden af plateautoppen er proportional med koncentrationen af frit lægemiddelstof i prøven indeholdende lægemiddelstof og liposom. Efterfølgende analyse af en standard med samme totale lægemiddelstofkoncentration som prøvens tillader umiddelbart bestemmelse af den fri fraktion af lægemiddelstof i liposomsuspensionen og dermed estimering af liposom-buffer-fordelingskoefficienten. Elektroferogrammerne i Figur 2A og B illustrerer således fordelingen af henholdsvis et negativt og positivt ladet lægemiddelstof til 80:20 mol% POPC/DPPA liposomer ved pH 7,4 og 25oC [Franzen et al. Manuskript under udarbejdelse].
På tilsvarende vis er lipofiliteten af en række lægemiddelstoffer bestemt i form af tilsyneladende fordelingskoefficienter. I denne serie af forsøg er det endvidere fundet, at resultaterne genereret ved CE stemmer nøje overens med resultater opnået ved hjælp af ligevægtsdialyse af lægemiddelstof-liposomsuspensionerne. Anvendelse af CE i stedet for eksempelvis ligevægtsdialyse og ultrafiltrering er forbundet med et lavere tidsforbrug og mindre prøvevolumina. Forudsætningerne for anvendelse af frontalanalyse-formatet er hurtig bindingskinetik, at lægemiddelstoffet kan separeres fra liposomerne og at lægemiddelstoffet kan detekteres, typisk ved UV-spektrofotometri. Studierne præsenteret i Figur 2 er udført med netto negativt ladede liposomer, hvilket efterligner det overskud af negativ ladning som cellemembraner har. Negativt ladede liposomer besidder en fordel i forhold til anvendelse af de sammensmeltede silicakapillarer som er standard i CE, fordi de ikke absorberer til kapillarvæggen. Adsorption af liposom til kapillarvæggen kan være ødelæggende for affinitetsbestemmelserne og kørselsbetingelserne må derfor optimeres for hvert liposom-buffersystem.
Små volumemængder
Muligheden for at håndtere meget små volumenmængder af et lægemiddelstof i liposomsystemer ved anvendelse af frontalanalyse-CE forventes, ud over bestemmelse af fordelingskoeficienter, at kunne benyttes i studier af liposombaserede drug delivery-systemer. Forudsat at følsomheden er høj nok, den evigt tilbagevendende akilleshæl for CE, vil inkorporeringseffektivitet samt lækage af lægemiddelstof fra liposomformuleringer over tid kunne studeres ved frontalanalyse-CE. Dette er potentielt af stor interesse i formuleringsudvikling og i færdigvarekontrol, hvor kun ganske små prøvemængder vil være tilgængelige. I en række igangværende studier undersøges det appetitregulerende peptidhormon ghrelins interaktion med 3 eksperimentelle liposomformuleringer ved hjælp af CE med henblik på at opklare formuleringernes indflydelse på den observerede farmakokinetik. På grund af ghrelins høje pris vil de fleste andre metoder være udelukket til udførelse af disse interaktionsstudier. Alt i alt indikerer de initiale erfaringer med håndtering af liposomer i kapillarer på, at CE vil være et attraktivt format for karakterisering af liposomer og deres vekselvirkninger med lægemiddelstoffer.
Referencer:
[1]Lasic, D. D., Biochem. J. 1988, 256, 1-11.
[2]Torchillin, V. P., Nature Reviews 2005, 4, 145-160.
[3]Avdeef, A., Curr. Topics Med. Chem. 2001, 1, 277-351.
[4]Mouritsen, O. G., Andersen, H. K., Andersen, J. S., Davidsen, J., Nielsen, L. K., Jørgensen, K., in: Testa, B., van de Waterbeemd, H., Folkers, G., Guy, R. (Ed.), Pharmacokintic optimization in drug research. Biological, physicochemical, and computational strategies, Weinheim , 2001, pp. 33-49.
[5]Gómez-Hens, A., Fernández-Romero, J. M., Trends Anal. Chem. 2006, 25, -167.
[6]Wiedmer, S. K., Jussila, M. S., Riekkola, M.-L., Trends Anal. Chem. 2004, 23, 562-582.
[7]Bilek, G., Kremser, L., Blaas, D., Kenndler, E., J. Chromatogr. B 2006, 841, 38-51.
[8]Østergaard, J., Anal. Sci. 2007, 23, 489-492.
[9]Østergaard, J., Jensen, H., Dansk Kemi 2004, 85, 32-35.
[10]Østergaard, J., Heegaard, N. H. H., Electrophoresis 2003, 24, 2903-2913.
[11] Østergaard, J., Heegaard, N. H. H., Electrophoresis 2006, 27, 2590-2608.
Figur 1. Skematisk repræsentation af fosfolipiderne 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) and 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat (DPPA), samt et unilamellært liposom. Lægemiddelstoffer, skitseret med rødt, kan befinde sig i liposomernes vandige hulrum, i lipiddobbeltlaget eller adsorberet til liposomernes overflade.
Figur 2. Elektroferogrammer. Fordeling af lægemiddelstoffer (A) warfarin og (B) propranolol til 80:20 mol% POPC/DPPA liposomer (A): 2,5 mg lipid/mL, (B): 0,25 mg lipid/mL i 10 mM HEPES-buffer tilsat 50 mM KCl. Røde UV-signaler er standardprøver uden liposom og blå UV-signaler er lægemiddelstof blandet med liposomopløsning. Højden af UV-signalerne er proportionale med koncentrationen af lægemiddelstof i den vandige fase. Det vil sige, at jo større reduktionen af UV-signalet er for lægemiddelstoffet ved tilstedeværelse af liposomer desto større affinitet har stoffet for liposomfasen.
CE betingelser: Ikke-coated silicakapillar (48,5 cm x 50 μm i.d., 40 cm effektiv længde), injektion: hydrodynamisk i 20 s (50 mbar), kørselsbuffer: 10 mM HEPES pH 7,40 tilsat 50 mM KCl, spænding: +15 kV (~ 45 μA), kapillartemperatur indstillet til 25ºC, detektion: 308 nm (warfarin) og 214 nm (propranolol).
