Lipidoxidation er en af de vigtigste årsager til at forkorte levetiden af fødevareemulsioner, der er rige på umættede fedtsyrer, især på grund af dannelsen af off-flavor. Ved måling af forskellige lipidoxidationsprodukter kan kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi give indsigt i mekanismerne.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2022 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af Marie Hennebelle1, Vincent Boerkamp1, Donny Merkx1,2,3 og John van Duynhoven2,3
1 Wageningen University & Research, Laboratory of Food Chemistry, Holland
2 Unilever Food Innovation Centre, Holland
3 Wageningen University & Research, Laboratory of Biophysics, Holland
Industrielle tilgange til at forhindre lipidoxidation omfatter typisk kølekædeopbevaring, sofistikeret emballage og brugen af kunstige antioxidanter (E-numre). Men for at imødekomme den stigende efterspørgsel fra forbrugere efter mere bæredygtige og naturlige fødevarer, er der et behov for, at der udvikles nye strategier. Denne udvikling er i øjeblikket hæmmet af manglen på hurtige (high-throughput) analysemetoder, der kan give mekanistisk indsigt i de reaktioner, der er i spil. I denne henseende kan NMR-spektroskopi bruges til at identificere og kvantificere forskellige oxidationsprodukter.
Måling af forskellige oxidationsreaktioner
Lipidoxidation er hovedsageligt styret af radikale kædereaktioner (figur 1). Ved primær oxidation udvindes et (bis)allylbrinte fra en umættet fedtsyre, hvilket giver et alkylradikal, der reagerer hurtigt med oxygen til dannelse af et peroxylradikal. Denne peroxylgruppe vil yderligere reagere med en anden umættet fedtsyre og på den ene side producere et nyt alkylradikal, der føder udbredelsescyklussen, og på den anden side et hydroperoxid, også omtalt som det primære produkt af lipidoxidation. I et senere stadie af lipidoxidationen resulterer nedbrydningen af hydroperoxider i forskellige sekundære oxidationsprodukter, såsom aldehyder og epoxider. Nogle af disse er flygtige og bidrager til dannelsen af off-flavor forbundet med lipidoxidation. Selvom reaktionerne er blevet udførligt beskrevet i olier, tilføjer grænsefladesammensætningen og den kolloide transportmekanisme i fødevareemulsioner en vis kompleksitet [1-3], og reaktionerne i et sådant system er indtil videre endnu ikke kortlagt.
Metoder, der almindeligvis anvendes til at vurdere lipidoxidation i fødevarer, inkluderer peroxidtal, thiobarbitursyre reaktive stoffer (TBARS), para-anisidin og hexanal. Disse analysemetoder er ofte tidskrævende. De formår heller ikke at give et omfattende overblik over lipidoxidationsprodukterne, der kan give indblik i de involverede reaktioner, da de for det meste udelukkende fokuserer på én type oxidationsprodukt. For nylig er NMR fremkommet som et lovende værktøj til at få mere mekanisk indsigt i lipidoxidationsveje. Elektron Spin Resonans (ESR) kan bruges til at kvantificere lipidradikaler dannet på et tidligt stadie, mens NMR-spektroskopi gør det muligt at overvåge dannelsen af flere lipidoxidationsprodukter, såsom hydroperoxider, aldehyder og epoxider (figur 1).
Elektron Spin Resonans (ESR) spektroskopi til måling af det tidlige lipidoxidation stadie
ESR-spektroskopi kan bruges til at monitorere radikaler og er blevet fremført som et lovende værktøj til at vurdere stabiliteten af fødevareemulsioner og effektiviteten af antioxidanter på et tidligt stadie af oxidationen (dvs. inden for timer eller dage afhængig af opbevaringsbetingelserne) sammenlignet med mere konventionelle metoder såsom peroxidtal, som typisk bruges over dage til uger [4]. På grund af deres høje reaktivitet og meget korte levetid (under 10-6 s) [5], påvises lipidradikaler normalt ved brug af en spintrap, der vil reagere med lipidradikalerne og danne et stabilt radikaladdukt, som herefter kan kvantificeres ved ESR. N-tert-butyl-α-phenylnitron (PBN) er en fedtopløselig spintrap, der almindeligvis anvendes til at monitorere autooxidation i fødevarer [6,7].
Ved at kombinere NMR med ESR-spektroskopi opdagede vi, at brugen af spintraps ændrer lipidoxidationsmekanismerne (figur 2). På den ene side hæmmer PBN dannelsen af hydroperoxider ved at fange peroxylradikaler. På den anden side nedbrydes PBN-addukter hurtigt til benzaldehyd, 2-methyl-2-nitrosopropan (MNP) og alkoxylradikaler, hvor de seneste fungerer som forløbere for aldehyder og muligvis andre sekundære produkter. Mens brugen af PBN-spintraps kan bruges til at rangordne effektiviteten af antioxidantruter, udelukker virkningen af PBN på oxidationsreaktionerne mekanistiske undersøgelser [4,8].
NMR-strategier til overvågning af forskellige lipidoxidationsproduktklasser i samme måling
NMR-metodikken har fordele ved at være en meget reproducerbar og hurtig analyse, der ikke kræver autentiske standarder for kvantificering. Når der arbejdes på rene olier eller ekstrakter af fødevarelipider, kan glycerolrygraden i triglycerider bruges som en intern standard. Af disse grunde har 1H NMR tiltrukket sig en del opmærksomhed i løbet af de sidste årtier i undersøgelser af lipidoxidation [9], og metoden har vist sig at give sammenlignelige resultater med de mere konventionelle, men også mere tidskrævende metoder.
En ulempe ved NMR-metoden er dens relativt lave følsomhed, hvilket kan gøre en nøjagtig kvantificering af forbindelser vanskelig, når de er til stede i lav koncentration. For at øge følsomheden kan der anvendes den strategi selektivt at excitere den del af NMR-spektret, der indeholder signaler af interesse. Ved at anvende sådanne selektive excitationssekvenser i 1H NMR-spektroskopi, kan hydroperoxider og aldehyder (dvs. henholdsvis primære og sekundære oxidationsprodukter) kvantificeres med en kvantificeringsgrænse (LOQ) på 0,03 mmol/kg olie [10]. Desuden formåede et studie ikke kun at identificere hydroperoxiderne baseret på deres vigtigste fedtsyreprecursor i vegetabilske olier (dvs. oliesyre, linolsyre og α-linolensyre), men også at generere information om specifikke strukturelle træk, såsom konformation af dobbeltbindingerne (cis eller trans) og positionen af hydroperoxidgruppen inden for (“indre”) eller uden for (“ydre”) dobbeltbindingssystemet (figur 3A).
For en nøjagtig identifikation og kvantificering af forbindelser ved 1H NMR, bør signalerne være fuldt opløst, dvs. ikke overlappe med andre signaler i spektret. Selvom dette ikke er et problem for hydroperoxiderne og aldehyderne, overlapper protonerne fra epoxider, som er en anden vigtig gruppe af oxidationsprodukter, hinanden, men også med de bisallyliske signaler fra flerumættede fedtsyrer [11]. I dette tilfælde kan en todimensional (2D) NMR-tilgang, såsom heteronuclear single quantum coherence (HSQC) anvendes. Ved at give information om både 1H og 13C kemiske skift giver en sådan 2D-tilgang mulighed for adskillelse og kvantificering af epoxider dannet under lipidoxidation (figur 3B) [12].
Fremtidsperspektiver
Den igangværende udvikling af rutineforsøg med NMR-spektroskopi til identifikation og kvantificering af forskellige intermediære lipidoxidationsprodukter vil åbne nye muligheder for at opklare kompleksiteten af lipidoxidationsreaktioner i fødevarer. Metoderne kan bringe ny mekanistisk indsigt i de reaktioner, der er i spil, og bidrage til en tidlig vurdering af oxidativ stabilitet, der kan bruges i udviklingen af nye antioxidantstrategier. Desuden giver disse hurtige og bredtfavnende metoder mulighed for etablering af eksperimentelle databaser, der kan bruges til at generere matematiske modeller til at prædiktere holdbarheden af lipidholdige fødevarer, og dermed bedre forstå den virkning som fødevarernes sammensætning og opbevaringsbetingelser har på holdbarheden [13].
E-mail:
Marie Hennebelle: marie.hennebelle@wur.nl
Referencer
1. McClements D.J., Decker E.A. Lipid Oxidation in Oil-in-Water Emulsions: Impact of Molecular Environment on Chemical Reactions in Heterogeneous Food Systems. Journal of Food Science. 2000;65(8):1270-82.
2. Berton‐Carabin C.C., Ropers M.H., Genot C. Lipid oxidation in oil‐in‐water emulsions: Involvement of the interfacial layer. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2014;13(5):945-77.
3. Laguerre M., Tenon M., Bily A., Birtić S. Toward a Spatiotemporal Model of Oxidation in Lipid Dispersions: A Hypothesis‐Driven Review. European Journal of Lipid Science and Technology. 2020;122(3):1900209.
4. Merkx D.W.H., Plankensteiner L., Yu Y., Wierenga P.A., Hennebelle M., Van Duynhoven J.P.M. Evaluation of PBN spin-trapped radicals as early markers of lipid oxidation in mayonnaise. Food Chem. 2021;334:127578.
5. Pryor W.A. Free radicals in autoxidation and in aging. Free radicals in molecular biology, aging and disease. 1984:13-41.
6. Velasco J., Andersen M.L., Skibsted L.H. Electron spin resonance spin trapping for analysis of lipid oxidation in oils: inhibiting effect of the spin trap α-phenyl-N-tert-butylnitrone on lipid oxidation. Journal of agricultural and food chemistry. 2005;53(5):1328-36.
7. Velasco J., Andersen M.L., Skibsted L.H. Evaluation of oxidative stability of vegetable oils by monitoring the tendency to radical formation. A comparison of electron spin resonance spectroscopy with the Rancimat method and differential scanning calorimetry. Food Chem. 2004;85(4):623-32.
8. Silvagni A., Franco L., Bagno A., Rastrelli F. Thermoinduced lipid oxidation of a culinary oil: a kinetic study of the oxidation products by magnetic resonance spectroscopies. J Phys Chem A. 2010;114(37):10059-65.
9. Martínez‐Yusta A., Goicoechea E., Guillén M.D. A review of thermo‐oxidative degradation of food lipids studied by 1H NMR spectroscopy: influence of degradative conditions and food lipid nature. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2014;13(5):838-59.
10. Merkx D.W.H., Hong G.T.S., Ermacora A., Van Duynhoven J.P.M. Rapid quantitative profiling of lipid oxidation products in a food emulsion by 1H NMR. Analytical chemistry. 2018;90(7):4863-70.
11. Xia W., Budge S.M., Lumsden M.D. 1 H-NMR characterization of epoxides derived from polyunsaturated fatty acids. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 2016;93(4):467-78.
12. Boerkamp V.J.P., Merkx D.W.H., Wang J., Vincken J-P., Hennebelle M, van Duynhoven JPM. Quantitative assessment of epoxide formation in oil and mayonnaise by 1H-13C HSQC NMR spectroscopy. Food Chem. 2022;In press.
13. Merkx D.W.H., Swager A., van Velzen E.J.J., van Duynhoven J.P.M., Hennebelle M. Quantitative and Predictive Modelling of Lipid Oxidation in Mayonnaise. Antioxidants. 2021;10(2):287.
