Vi har udviklet en LC/ESI-MS3 metode til at adskille og detektere D- og L-asparaginsyre (Asp) for at kunne bestemme alderen af pattedyrs tænder. Under metodeudviklingen blev vi overrasket ved at opdage, at en spænding på elektrospray nålen på 0 V gav en 40 gange forbedring i signal støjforholdet med en detektionsgrænse på 0.2 ng for asparaginsyre til følge. Dannelsen af gasfaseioner ved 0-volts ESI metoden foregår formentlig på samme måde som ved sonic spray ionisering (SSI).
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 9, 2008 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Morten B. SørensenPaP, Per AasloPaP, Helge EgsgaardPbP and Torben LundPaP*
Pa PInstitut for Natur, Systemer og Modeller, Roskilde Univesitetscenter. Pb P Afdeling for Biosystemer, Risø, DTU
For seks år siden blev vi involveret i et projekt, der drejede sig om aldersbestemmelse af sæler og hvidhvaler ved hjælp af D/L-asparaginsyre epimeriseringsmetoden.1-3 Biologer benytter traditionelt tandslibsmetoden, der bedst kan sammenlignes med årringstælling af træer.4 (Se figur1). Imidlertid er aldersbestemmelse ved hjælp af tandslibsmetoden ikke altid pålidelig, idet der kan dannes mere end ét vækstlag pr. år i tænder fra spættet sæl og hvidhvaler. Herudover kan det være svært at skelne vækstlagene fra hinanden i meget gamle tænder og en supplerende kemisk aldersbestemmelsesmetode vil derfor være ønskelig.
Aldersbestemmelse med asparaginsyremetoden
Bada introducerede i 1975 den såkaldte D/L-aminosyre epimeriseringsmetode til aldersbestemmelse af mennesker, pattedyr og mumier.1-3
Metoden bygger på den kendsgerning, at proteiners L-aminosyrer langsomt epimeriserer via en anionisk mekanisme til D-aminosyrer.5 (Se figur 2). I levende væv fornyes proteinerne til stadighed og der findes enzymsystemer, der kan reparere på skaderne som følge af epimeriseringsprocessen. I inaktivt biologisk væv f.eks. dentinen i tænder, øjelinseprotein samt i væv fra døde organismer omdannes L-aminosyrene ind til ligevægt dvs. lige meget af både L og D aminosyren.
Epimeriseringshastigheden k varierer op til 10 størrelsesordner mellem de 20 naturligt forekommende aminosyrer og er størst for asparaginsyrer (Asp).6 Det antages almindeligvis at den usædvanlig høje epimerinseringshastighed for asparaginsyre skyldes dannelsen af et succimid intermediat. Epimeriseringshastigheden L D afhænger kun af temperaturen og forholdet mellem D og L-asparaginsyre. Den kinetiske løsning af den simple reaktionsligning (1) er givet i (2), hvor k er epimeriseringshastigheden, t epimeriseringstiden (D/L)0 er aminosyre enatiomerforholdet til tiden t = 0.
For asparaginsyre er kasp = 7,8 10-4 år-1 ved 37 ºC svarende til 0.2% pr. år. Asparaginsyren i øjelinseproteinet i en 70 årig person består således af ca. af 14% D-asparaginsyre.
Bestemmelse af D/L forholdet i aminosyrer
Aldersbestemmelse af tænder indledes med at hydrolyserer tanddentinens proteiner til frie aminosyrer ved en behandling i 6M HCl i 6 timer ved 90 ºC. Herefter tilsættes acetonitril til hydrolysatet, hvorefter aminosyrene findes i acetonitrilfasen; acetonitril er ikke blandbart med 6 M HCl som indeholder høje koncentrationer af uorganiske ioner stammende fra tændernes indhold af bl.a. calcium appatit. Acetonitriloprensningsmetoden er en RUC nyskabelse inden for feltet. Ved pH = 0 sker der overraskende nok ingen epimerisering af aminosyrerne. Herefter kan D og L-asparaginsyreforholdet bestemmes ved hjælp af metoderne 1-3:
1) Derivatisering med OPA og acetyleret L-cystein (NAC) under dannelse af et diastereomert par som herefter adskilles ved traditionel omvendt fase kromatografi (C18 kolonne) efterfulgt af UV eller fluorescens detektion.7
2) Forestring og acetylering efterfulgt af en adskillelse på en chiral GC søjle og massespektrometrisk detektion.8
3) Adskillelse af L og D-asparaginsyre på en chiral HPLC søjle og detektion af den ikke derivatiserede aminosyre med elektrospray massespektrometri.
I metoderne 1) og 2) som er illustreret i figur 3, vil der under derivatiseringen kunne forekomme epimerisering, hvilket ville give et forkert D/L forhold og dermed en fejlbehæftet aldersbestemmelse. Vi vurderede derfor, at en direkte adskillelse af de to enantiomere former uden forudgående derivatisering burde være den mest optimale metode. Lærerbøgerne inden for LC-MS foreskriver, at elektrospray er særdeles velegnet til polære molekyler og ioner, så en LC-ESI-MS strategi forekom lovende.
0 volts ESI
Det viste sig imidlertid hurtigt, at elektrospray ikke var særligt effektiv til ionisering af de meget polære aminosyrer som f.eks. asparaginsyre. Normalt kan vi på vores LCQ-deca ion trap massespektrometer bestemme testforbindelsen reserpine ned til 5 pg injektieret på kolonnen; men for asparaginsyre var følsomheden mindst 2000 gange dårligere ( > 10 ng) og således langt fra følsom nok til aldersbestemmelsesformålet.
Vi forsøgte gennem længere tid ihærdigt at forbedre følsomheden ved at variere HPLC solventsammensætningen og massespektrometriske indstillinger; men uden nævneværdig succes. Vi var på nippet til at opgive LC-MS, da de studerende i deres ihærdige optimeringsforsøg fandt på at fjerne elektrospray nålens spænding fuldstændig. Til vores euforiske begejstring observerede vi nu helt uventet et kromatogram af en racemisk blanding af D og L-asparaginsyre med et signal støjforhold (S/N), som var 40 gange bedre end det tilsvarende kromatogram optaget under standard ESI betingelser. (Se figur 4). I lærerbøger om elektrospray massespektrometri fremgår det, at nålens spænding mindst skal være 2.1 kV med methanol og 4.5 kV med vand som eluent,9 såfremt elektrosprayprocessen overhovedet skal kunne forløbe og i instrumentmanualerne står der med fede typer, at elektrospray spændingen aldrig bør ændres udover 4-6 kV. Det krævede således en vis naturlig ”frækhed” overfor autoriteterne for at man finder 0 volts indstillingen. Heldigvis besidder mange RUC studerende denne egenskab.
Vi undersøgte efterfølgende 0 volts effekten på 17 aminosyrer og fandt, at for de mere polære aminosyrer (Glu, Asn, His, Ser, His, Ser, Asp, Arg, Tyr og Lys) var både signalstyrken og S/N i kromatogrammerne højere ved 0V end ved 4 kV. (Se tabel 1). For aminosyrer med medium sidgruppepolaritet (gruppe 2) var intensiteterne i kromatogrammerne mindre end ved 4 kV; men S/N var fortsat højere. Endelig var der en gruppe aminosyrer (Gruppe 3) hvor både intensitet og S/N var ringere end under standard elektrospray indstillinger.
0V ESI og sonic spray ionisation
Ioniseringseffektiviteten med 0 volts ESI afhænger meget af forskellige instrumentelle indstillinger såsom sheat gasflow, HPLC flow, afstand fra nål til åbningen indtil massespektrometeret og heated capillary temperaturen. Sheatgas flowet ledes i elektrospray interfaset i vore LCQ-deca iontrap massespektrometer forbi elektrospray nålen for at øge fordampning af de i elektrospray processen dannede små ladede dråber. For at kunne observerer en 0V ESI effekt skal sheatgasflowet være højt dvs. fra 4-6 l/min, som det fremgår af figur 5. HPLC flowet bør være over 0,2 ml/min og heated capillary temperaturen omkring 220 ºC for at opnå den optimale 0 volts ESI signal.
Vores manuskript til Rapid Communication of Mass Spectrometry10 undergik en særdeles kritisk; men også meget givende evaluering. Således gjorde en referee os opmærksom på, at vores 0 V ESI mindede om sonic spray ionisering, som Hirabayashi et al. var de første til at lancere i 1994.11 Hirabayashi undersøgte ionisering uden nålespænding i et speciel designet interface, som i konstruktion minder om vores ESI interfase, og som de døbte sonic spray ionisering. sonic spray ledes kvælstofmolekyler forbi nålen med hastigheder højere end lydens hastighed heraf navnet sonic spray. Figur 5 er næsten identisk med en tilsvarende figur i Hirabayashi artikel fra 1995,11b hvilket bestyrker os i troen på at 0V ESI og sonic spray ionisering er identiske ioniseringsformer. Vi har bibeholdt navnet 0V ESI, idet vi har benyttet et kommercielt tilgængeligt ESI interface til forsøgene og finder således vores ”navngivelse” mere informativt.
Et skematisk billede af et typisk sonic spray interface er vist i Figur 6. 12 Ved sonic spray processen genereres et meget stort antal små dråber med en diameter mindre end 1 mm.12 Elektrolytionerne i spayen, som f.eks. kan bestå af Na+, Cl-, NH4+, H+, OH- m.m. fordeles tilfældigt sammen med analyt molekylerne (statistical sampling) i de små dråber og danner dråber med en negativ, nul og en positiv overskudsladning. Analytmolekylerne i den ladede dråbe kan nu på helt analog måde som i elektrospray overføres til gasfasen via charge residual (CRM) eller Irbane Thomsson ion fordampningsmodellen.9
Sonic spray ioniseringsformen er ukendt for de fleste LC-MS brugere, men vinder hastigt indpas hvilket en søgning på Scifinder vil bekræfte. En søgning på ”sonic spray ionization mass spectrometry” gav således 65 hits i august 2008. På den nylig afholdte analytisk kemiske konference, DANSAK-9, på DTU gav Prof. Marcos Eberlin fra universitetet i Campinas et fremragende foredrag, hvor han omtalte easy ambient sonic spray ionization – mass spectrometry (EASI-MS). I denne teknik anvendes sonic spray til at bringe molekyler fra forskellige overflader i gasfase som ioner.13 Prof. Eberlin pointerede, at sonic spray ligger i toppen af massespektrometriens ioniseringsudviklingstræ og er helt uden brug af ”the bad guys” varme og højspænding. Sonic spray er en endnu blødere ioniseringsform end ESI formentlig fordi solvent og gasmolekylerne bliver afkølet under den supersoniske proces. LC-MS brugere er vant til at teste om elektrospray ionisering i positiv eller negativ mode giver det bedste LC-MS kromatogram. Vort budskab er, at man også bør inkludere 0 volts ESI eller sonic spray optionen.
Aldersbestemmelser med LC/ESI (0V)-MS3
I vore bestræbelserne på at udvikle den mest følsomme metode til bestemmelse af D og L-asparaginsyre ioniserede vi med 0 volts ESI og detekterede asparaginsyren ved hjælp af en MS3 metode, hvor m/z = 134 [M+H] i iontrap massespektrometret nedbrydes som vist i Figur 7 og med detektion på basis af m/z = 46 fragmentionen.
I figur 8 ses LC-MS3 kromatogrammet af en fortand, som vi venligst modtog fra en lokal tandlæge. Forholdet mellem D og L-asparaginsyre var 0.0304, hvilket giver en alder af tanden på 21 år. Hvis vi antager, at fortanden var færdig-mineraliseret i 10 års alderen er personens alder lig med 21 + 10 = 31 år, hvilket stemte godt overens med personens faktiske alder på 32 år.
Aldersbestemmelse af sæler
Sæltænder er meget mindre end mennesketænder og på trods af følsomhedsforbedringen ved brug af vores 0 volts ioniseringsmetode var LC-MS3 metoden ikke tilstrækkelig følsom til at detektere de meget små mængder D-asparaginsyre i helt unge sæler.
For derfor at kunne foretage de ønskede aldersmålinger på en population af 234 indsamlede sæler, som døde under sælpestepidemien i sommeren 2002, valgte vi GC-MS metoden omtalt i artiklens indledning. I figur 9 ses en GC-MS analyse foretaget på en sæltandshydrosylat efter forestring med 1-propanol og acylering med trifluoreddikesyreanhydrid. En række sæltænder blev aldersbestemt med GC-MS metoden og sammenholdt med aldersbestemmelser foretaget med tandslibsmetoden af ansatte på DMU´s Arktiske afdeling. I figur 10 ses en sammenligning af den kemiske og biologiske aldersbestemmelsemetode på 12 sæler med forskellige aldre. Med en epimeriseringshastighed på
k = 1,97 ×10-3 år-1 ses en meget flot overensstemmelse mellem tandslibs og asparaginsyrealdersbestemmelserne. Vi konkluderede, at vi ved den kemiske metode kunne bestemme sælers alder med en nøjagtighed af ± 1 år.14 D/L-asparaginsyremålinger udgør således et nyttigt supplement til aldersbestemmelser ved hjælp af tandslibsmetoden.
Referencer:
(1) Helfman PM, Bada JL, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1975; 72: 2891–2894.
(2) Bada JL, Brown S, Masters PM, Rep. Int. Whal. Commn 1980; 3: 113–118.
(3) George CJ, Bada, JL, Zeh J, Scott L, Brown SE, O´Hara T, Suydam R, Can. J. Zool. 1999; 77: 571–580.
(4) Dietz R, Heide-Jørgensen MP, Härkönen T, Teilmann J, Valetin N, Sasia 1990, 76, 17-21.
(5) Radkiewicz JL, Zipse H, Clarke S, Houk KN, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9148-9155.
(6) Smith GG, Reddy GV, J. Org. Chem. 1989, 54, 4529-4535.
(7) Zhao M, Bada JL, J. Chromatogr. A 1995; 690: 55–63.
(8) Bruckner H, Justus J, Kirschbaum J, Amino Acids 2001; 21: 429–433.
(9) Kebarle P, Ho Y, Electrospray Ionization Mass Spectrometry; Fundamentals, Instrumentation & Applications, Cole RB, ed.; John Wiley & Sons, Inc., New York 1997.
(10) Sørensen M. B, Aaslo P, Egsgaard H, Lund T, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 455-461.
(11) a) Hirabayashi A, Skairi M, Koizumi H, Anal. Chem. 1994; 66: 4557-4559. b) Anal. Chem. 1995; 67, 2878-2882.
(12) Benijts T, Günther W, Lambert W, De Leenheer A, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17: 1866-1872.
(13) Haddad R, Sparrapan R, Eberlin M, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006; 20: 2901-2905.
(14) M. B. Sørensen og P. H. Aaslo ” Aldersbestemmelse af Vadehavsæler ud fra måling af D/L aspartat epimerisering i tænder” Speciale RUC 2005.
Figur 1 Tandslib af en gammel og en ung hvidhvalstand. Alderen af hvalen bestemmes ud fra antallet af vækstlag analogt til aldersbestemmelse af træer ud fra årringstællinger.
Figur 2 Anionisk epimeriseringsmekanisme af aminosyrer i proteiner. I asparaginsyre er R = CH2COOH.
Figur 3 a) Dannelse af et diastereomert par (RS)-2 og (RR)-2 ud fra OPA-NAC derivatiseringen. Produkterne kan separeres på en almindelig C18 HPLC søjle. b) Forestring og acetylering af asparaginsyre. De derivatiserede R og S enantiomerene adskilles på en chiral Lipodex E cyclodekstrin GC søjle.
Figur 4 Chiral separation på en Chirobiotic T chiral analytisk kolonne af 10 mL af en D- and L-asparaginsyreopløsning ([L] = [D] = 0.10 g/L). L formen eluerer før D formen. Adskillelsen blev udført isokratisk i en opløsning af 90% methanol, 9% vand, og 1% af en 30% NHB3B opløning i vand med et eluentflow 0.3 mL/min. Eluentens pH blev justeret til 4.1 med myresyre. Kromatogrammet blev optaget med SIM, m/z = 134 svarende til massen af den protonerede asparaginsyre molekyle [M+H]+ og nålepotentialet 0 V (rød kurve) og 4 kV (sort kurve).
Figur 5 Seks LC-MS/SIM kromatogrammer blev optaget af en racemisk blanding af D og L asparaginsyre med nålepotentialet 0 V og forskellige sheath gas flow.
Figur 6 Skematisk diagram af et sonic spray ioniserings (SSI) interphase. Figuren taget fra reference 12 med tilladelse fra Wiley InterScience.
Figur 7 MS3 nedbrydning af protoneret asparaginsyre [M+H]+ i iontrap massespektrometret.
Figur 8 Chiral analyse af ikke derivatiseret asparaginsyre i en hydrolyseret mennesketand. Ionsporet m/z 46 er optaget med LC-MSP3P (m/z 134 à(116) à 88 à 46).
Figur 9 Kromatogrammet viser en chiral GC-MS analyse af derivatiseret asparaginsyre i et sæltandshydrosylat. Ved retentionstiden 25,08 min ses D-asparaginsyre og ved 26,06 min
L-asparaginsyre. Ud fra D/L forholdet = 0,037 blev sælens alder beregnet til 9,6 år.
Figur 10 Grafen viser præcisionen mellem aldersbestemmelsen af 12 sæler bestemt ved tandslibsmetoden udført på DMU mod GC-MS metoden. Den grønne kurve angiver sælernes aldre bestemt med en litteraturværdi for epimeriseringshastigheden i sæltænder k = 1,25 10-3 år-1. Den sorte kurve er sælernes alder beregnet ud fra k = 1,97 10-3 år-1.
