Oxidativ, enzymkatalyseret nedbrydning af plantebiomasse er et voksende forskningsfelt i forbindelse med enzymatisk nedbrydning og bioraffinering af lignocellulose.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 6, 2023 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af Caio D.O.G. Silva, Anne S. Meyer og Jane W. Agger, DTU Bioengineering, Danmarks Tekniske Universitet
Det komplicerede samspil mellem forskellige oxidative enzymer, der udskilles af skimmelsvampe under biomassenedbrydning, har for nylig fået betydelig forskningsmæssig opmærksomhed. I den forbindelse er de kobberholdige lytiske polysaccharid monooxygenaser, LPMOer, en særlig interessant gruppe enzymer, idet de spiller en central rolle i katalysen af den oxidative spaltning af krystallinsk cellulose. Detaljerne i LPMOers katalytiske mekanisme er genstand for intens forskning, især for at forstå, hvordan forsyningen af elektroner, der understøtter LPMOernes katalytiske aktivitet, foregår på det molekylære niveau.
Ny forståelse af LPMOer
Det står nu klart, at LPMOer ikke kun er monooxygenaser, som oprindeligt beskrevet. For at katalysere monooxygenase-reaktioner skal LPMOer bruge oxygen til at indføje en hydroxylgruppe til et af C-atomerne i forbindelse med den katalytiske spaltning af en β-1,4-glykosidbinding i cellulose (figur 1). En sådan hydroxylering fører til destabilisering og efterfølgende spaltning af glykosidbindingen. For at opretholde en kontinuert katalyse kræver monooxygenase-reaktionen, udover ilt, en kontinuerlig tilførsel af elektroner til kobber-ionen i LPMO-enzymets aktive site, konkret kræves 2 e– til hver katalytisk runde (figur 2).
Mens man typisk bruger askorbinsyre (vitamin C) som elektrondonor i laboratorieforsøg med LPMO-katalyserede reaktioner, vil elektronerne i naturen skulle komme fra andre kilder. Formentlig forsynes elektronerne enten fra stoffer, som er naturligt til stede i substratet, for eksempel phenoliske komponenter eller andre forbindelser; disse aktiveres sandsynligvis via andre enzymer, som skimmelsvampene udskiller, mens de vokser på plante-biomassen. Alternativt leveres elektronerne direkte fra forskellige reducerende stoffer, som skimmelsvampen secernerer. Imidlertid var det længe en gåde, hvordan eksterne elektrondonorer kontinuerligt kan levere elektroner til det aktive site i LPMOer under katalyse med O2, og visse detaljer er stadig uklare.
Det var et ægte paradigmeskift, da det i 2017 blev vist, at hydrogen peroxid (H2O2), snarere end O2, er det foretrukne co-substrat til LPMO-katalysen på cellulose, og at H2O2 samtidig eliminerer behovet for forsyningen af elektroner andetstedsfra til den kontinuerlige katalytiske oxidation [1,2]. Til denne såkaldte LPMO peroxygenase-aktivitet leverer H2O2 således også de elektroner, der kræves til cellulosespaltningen, dog undtaget den første indledende elektron, som kræves for at udløse reaktionen. Denne indledende elektrondonation, kaldet ”priming”-reaktionen, er en initieringsreaktion, der er afgørende nødvendig for at reducere kobberionen Cu(II) i enzymets aktive site fra enzymets ”hviletilstand” til reaktivt Cu(I), som kræves til katalysen. Priming-reaktionen antages at finde sted, inden enzymet binder til cellulose. Vi har for nylig vist, at hvis både cellulose og H2O2 er til stede, kan flere spaltningscyklusser udfolde sig efter en enkelt priming-reduktion, fordi Cu(I)-tilstanden opretholdes ved afslutningen af hver cyklus (figur 2) [3].
At opfattelsen oprindeligt var, at LPMOer var oxygenaser, som primært brugte O2 som substrat, skyldes, at de LPMO-enzymer, som ikke er bundet til cellulose, tilsyneladende selv kan levere små mængder H2O2 via oxidation, såfremt O2 og reduktionsmidler er til stede. Det har senere vist sig, at andre enzymer som svampen udskiller samtidig, for eksempel laccase, ligeledes kan producere små mængder H2O2 [4]. Det er klart en mulighed, at denne type H2O2-produktion kan sætte gang i peroxygenase LPMO-reaktionen (figur 2). Samlet set indikerer disse observationer, at den oprindelige monooxygenase-aktivitet, som har lagt navn til LPMO-aktiviteten, i virkeligheden er et resultat af peroxygenase-reaktioner, der er drevet af H2O2 genereret in situ [2].
H2O2 spiller central rolle
I vores studier af disse enzymreaktioner på DTU har vi for nylig opnået resultater, der bekræfter paradigmet om, at peroxygenase dominerer over monooxygenaseaktivitet i LPMOer [3]. Vores resultater viser, at diphenoler (typisk i form af dihydroxybenzener), effektivt fremmer LPMO-primings-reaktionen, men ikke hverken H2O2-dannelse via autooxidation eller LPMO-monooxygenase aktivitet. Disse data understøtter dermed, at der kræves H2O2 til den LPMO-katalyserede cellulosespaltning. Når diphenoler anvendes som reduktionsmidler, er cellulosespaltning med LPMO alene således kun mulig ved eksogen H2O2-tilførsel.
Det særligt interessante ved dette er, at diphenoler såsom 3-methoxycatechol og 3,4-dihydroxy-5-methoxybenzosyre let kan dannes fra lignin-afledte monophenoler såsom guaiacol og vanillinsyre via en ortho-hydroxyleringsreaktion katalyseret af fungale polyphenol oxidaser – i vores arbejde konkret med en polyphenoloxidase, MtPPO7, fra skimmelsvampen Myceliophthora thermophila (svampen kaldes også Thermothelomyces thermophilus). Den konkrete polyphenoloxidase MtPPO7 katalyserer omdannelsen af methoxylerede monophenoler, der typisk produceres under svampens lignin-nedbrydning. Vores data tyder på, at polyphenoloxidase-reaktionen kan spille sammen med LPMOer i cellulosenedbrydning, udover at aktiviteten i sig selv kan katalysere nye kemiske funktionaliseringer på lignin og lignin-afledte forbindelser. Opdagelsen betyder med andre ord, at polyphenoloxidasen spiller en rolle i ”priming” af LPMO enzymernes kobber, at polyphenoloxidasen ikke deltager i den videre understøttelse af LPMO-aktiviteten, men samtidig kan være et redskab til at funktionalisere lignin-komponenter.
Afsløringen af disse reaktioner, er de facto også opdagelsen af en ny skalérbar metode til at kontrollere H2O2-forsyningen til LPMO-katalyse. En kontrolleret forsyning af H2O2 reducerer risikoen for enzyminaktivering, der typisk observeres, når overskydende H2O2 akkumuleres i reaktionen. Yderligere viden venter forhåbentlig, når vi dykker endnu dybere ned i samspillet mellem forskellige typer oxidative enzymer, der er involveret i at nedbryde plantebiomasse.
E-mail:
Anne S. Meyer: asme@dtu.dk
Referencer/yderligere læsning
1. B. Bissaro, A.K. Røhr, G. Müller, P. Chylensky, M. Skaugen, Z. Forsberg, S.J. Horn, G. Vaaje-Kolstad, V.G.H. Eijsink, Nat Chem Biol. 2017, 13, 1123-1128.
2. B. Bissaro, V.G.H. Eijsink, Essays Biochem. 2023, 67, 575-584.
3. C. De Oliveira, G. Silva, M. Vuillemin, M.A. Kabel, W.J.H. Van Berkel, A.S. Meyer, J.W. Agger, ChemSusChem 2023, e202300559.
4. V. Perna, A.S. Meyer, J. Holck, L.D. Eltis, V.G.H. Eijsink, J.W. Agger, ACS Sust Chem Eng, 2020, 8, 831-841.
