Med trevejs-data kan man lave kalibreringsmodeller, som er mere generelle og anvendelige end traditionelle kalibreringsmodeller. Det kaldes anden-ordens kalibrering og var det, der startede multivejsanalyse i kemometrien.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2013 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Rasmus Bro, Søren Balling Engelsen, Institut for Fødevarevidenskab, Københavns Universitet og Lars Nørgaard, FOSS
Den traditionelle metode til at opbygge kalibreringsmodeller, involverer typisk en række enhedsoperationer. Ved at lave ekstraktion, fældning osv. kan man opnå, at den analyserede prøve kun indeholder det stof, man er interesseret i at kvantificere. Dermed er det nemt at kvantificere ved f.eks. at lave en standardrække af prøver med kendt koncentration. Disse måles med en passende teknik, som giver et signal, der er lineært med koncentrationen i det ønskede område. Det kunne være absorption ved 340 nm. Nu kan man så kvantificere analytten i en ukendt prøve blot ved at måle absorptionen ved 340 nm og så aflæse koncentrationen i sin kalibreringsmodel (regressionsmodel) som vist i figur 1.
Univariat kalibrering anvendes i en lang række situationer og er den dag i dag den fremherskende metode i analytisk kemisk kalibrering. Kalibreringsmodellen er baseret på måling af et tal for hver prøve; dvs. en skalar måling. En skalar kaldes også en nulte-ordens tensor, og derfor kaldes sådan kalibrering også nogle gange nulte-ordens kalibrering.
Der er flere krav til, hvordan man sikrer gode resultater, og et af de vigtige aspekter er, at signalet, man måler, skal være selektivt. Er der andre stoffer i prøven, som også giver signal, såkaldte interferenser, så kan man ikke stole på prædiktionerne (figur 2). Hvad, der måske endda er endnu værre, er, at man ikke kan kontrollere sin måling for at verificere om målingen er i orden. Man kan ikke se på en absorbans-måling på 0.8, om det er passende eller ej. Det vil sige at nulte-ordens data ikke tillader en intern kvalitetskontrol.
Første-ordens kalibrering
I kemometrien har man løst problemet med interferenser vha. multivariat kalibrering som eksempelvis partial least squares regression (PLS). I multivariat kalibrering anvender man ikke blot én variabel, f.eks. én bølgelængde, men anvender i stedet mange målinger eller målepunkter for hver prøve. Det kan være i form af et spektrum som vist i figur 3. Multivariat kalibrering kaldes også første-ordens kalibrering, fordi hver måling nu er en vektor (første-ordens tensor) fremfor en skalar.
Dermed behøver man ikke længere at have selektive signaler; altså fuldstændigt rene signaler. Man kan håndtere ukendte interferenser, så længe man sikrer sig, at også disse varierer i det datasæt, man anvender til kalibrering (figur 4).
Man får i tillæg også mulighed for at kontrollere om en ny prøve, der skal prædikteres, passer i modellen. Ud fra prøvens form kan man se, om prøven er af samme type som kalibreringsprøverne (outlier-kontrol – Dansk Kemi, 89(3), 2008). Det betyder, at første-ordens kalibrering tillader ikke-selektive signaler og har indbygget intern kvalitetskontrol (figur 5).
En håbløs situation
Første-ordens kalibrering løser mange af de problemer, som den traditionelle analytisk kemiske metode byder på. Men ikke alle problemer! Antag at man ønsker at kvantificere en analyt i en kompleks prøve, hvor mange forskellige kemiske komponenter (interferenser) giver signal. Og antag at man kun har adgang til en ren standard til formålet. Nulte-ordens kalibrering kommer til kort, hvis man ikke kan fjerne interferenserne, og første-ordens kalibrering kan heller ikke løse problemet, fordi man ikke har de nødvendige data til at opbygge en kalibreringsmodel.
Anden-ordens kalibrering
Der findes imidlertid en metode, som hedder anden-ordens kalibrering, og den rummer løsningen på problemerne i såvel klassisk som moderne kalibrering. Metoden kan bedst eksemplificeres på den måde, som den oprindeligt blev udviklet i sluthalvfjerdserne og firserne. I anden-ordens kalibrering er hver prøves måling ikke en vektor (et spektrum), men derimod en tabel/matrix (et landskab af spektre).
I figur 6 er vist et eksempel på et typisk kalibreringsproblem i anden-ordens kalibrering.
Vi ønsker at bestemme koncentrationen af tyrosin i en ukendt prøve (figur 6 til højre). Prøven indeholder imidlertid også signal fra andre fluoroforer, og vi har dermed ikke et selektivt signal fra tyrosin. Ud over den ukendte prøve har vi også et kaliberingsdatasæt. Det består af én ren prøve, hvori vi kender koncentrationen af tyrosin. Den er 13,3 µM. Nu er problemet at kunne bestemme koncentrationen af tyrosin i den ukendte prøve. Den traditionelle anden-ordens kalibrering fungerer ved, at man trækker en vægtet udgave af standardprøven fra den ukendte prøves måling. Den ukendte prøve har i dette tilfælde en rang på tre, fordi der er tre kemiske stoffer, der giver signal. Hvis man trækker præcis så meget af standarden fra, at tyrosins signal forsvinder fra den ukendte prøve, så falder rangen til to. Dermed har man en metode til at kvantificere tyrosin. Man prøver at trække forskellige fraktioner af den rene prøves signal fra den ukendte og følger rangen som funktion af dette. Ved den rette fraktion ændres rangen som vist i figur 7.
Ovenstående kalibreringsmetode hedder RAFA (rank annihilation factor analysis) og var den første af en række metoder, der anviste de unikke muligheder i anden-ordens kalibrering [1-2].
Outro
I kalibrering gælder det, at nulte-ordens kalibrering kræver selektivitet og ikke tilbyder nogen form for ”indbygget” kvalitetskontrol. Første-ordens kalibrering virker også på ikke-selektive signaler og har endda indbygget kvalitetskontrol. Her har vi set, at anden-ordens kalibrering tilbyder endnu flere muligheder. I næste klumme vil vi se nærmere på dette, som i litteraturen benævnes anden-ordens fordelen.
Referencer
1. C. N. Ho, G. D. Christian, E. R. Davidson. Application of the method of rank annihilation to quantitative analyses of multicomponent fluorescence data from the video fluorometer. Anal.Chem. 50:1108-1113, 1978.
2. L. Nørgaard, C. Ridder. Rank annihilation factor analysis applied to flow injection analysis with photodiode-array detection. Chemom.Intell.Lab.Syst. 23:107-114, 1994.
Figur 1. Eksempel på opbygning af kalibreringsmodel ved en standardrække af seks prøver og en lineær regressionsmodel.
Figur 2. Samme som i figur 1, men prøven indeholder nu en ukendt interferens, som også giver signal. Dermed bliver den estimerede koncentration i prøven forkert.
Figur 3. Spektralt datasæt. Frem for blot én bølgelængde kan man i f.eks. PLS-baseret kalibrering anvende det fulde spektrum.
Figur 4. PLS-kalibrering gør det muligt at håndtere ukendte interferenser, så længe disse varierer i kalibreringsdatasættet.
Figur 5. Ikke-kalibrerede interferenser (grønt spektrum) kan ikke håndteres, men disse kan detekteres som outliere.
Figur 6. Til højre fluorescens-EEM af ukendt prøve, der bl.a. indeholder tyrosin. Til venstre fluorescensmåling af ren tyrosinprøve med kendt koncentration.
Figur 7. ”Rang” (egentlig singulære værdier) af trekomponent-system som funktion af subtraktion af en ren tyrosinprøve. Ren tyrosinprøve er 13.3 µM, så den ukendte prøve må have en koncentration på 13.3•0.4 =5.3 µM – i virkeligheden er koncentrationen 5.44.
