Kogalskab – BSE – er en såkaldt prionsygdom. Prionproteinet er ud over at være et fascinerende eksempel på en ny type molekylær sygdomsmekanisme også grundlaget for identifikation af smitte med prionsygdomme. Her beskrives prionproteinet og sammenhængen mellem struktur og overførsel og udvikling af sygdommen.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2001 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Peter M.H. Heegaard, Statens Veterinære Serumlaboratorium, Afdelingen for Biokemi & Immunologi,
Spongiforme encephalopatier er en gruppe gådefulde og dødelige neurodegenerative sygdomme. De optræder normalt med ganske lav frekvens og karakteriseres ved en progressivt forløbende udvikling af neurologiske forstyrrelser sluttende med død og en række forandringer i hjernen, der omfatter dannelse af hulrum (vakuolisering) og proteinudfældning i form af proteinaflejringer (plaques).
Der ses ingen immunreaktion hos værten og inkubationstiderne er, afhængig af art og type overførbare (transmissible) spongiforme encephalopatier (TSE’r), meget lange, nemlig fra ca. 1 år op til 40 år.
Et andet typisk træk er TSE’ernes artsspecifictet, som betyder at en TSE normalt kun kan medføre sygdom i den samme art. Denne artsbarriere kan ofte brydes eksperimentelt ved direkte indpodning i hjernen på en anden art, men vil da først give anledning til TSE efter længere inkubationstid end ved indpodning af værtsspecifikt smitstof.
En vigtig og enkeltstående undtagelse fra denne regel er BSE (se nedenfor). Det er vigtigt at bemærke, at nogle typer af TSE kan tilpasses til en ny art ved passage gennem den nye art, i særlige tilfælde endda uden i første omgang at give anledning til sygdom.
Disse sygdomme har fået ny aktualitet ved den epidemi af kogalskab (bovin spongiform encephalopati, BSE), der blev konstateret for første gang i England i 1986 [1]. Epidemien havde sit højdepunkt i starten af 1990’erne med op til 3000 kliniske tilfælde om måneden, og den ramte op imod 180.000 stykker kvæg i England og Nordirland i perioden 1986-2001. I Danmark er der indtil videre diagnosticeret 3 køer smittet med BSE.
Den bedst kendte TSE er scrapie, som ses hos får og geder. Scrapie har været kendt siden midten af 1700-tallet og dens overførbarhed (transmissibilitet) blev beskrevet allerede i 1930’erne. Sygdommen kan overføres ved indpodning af rygmarvsmateriale fra scrapie-smittede får. Scrapie er bl.a. udbredt i engelske og norske fårebestande. Den er særdeles svær at komme af med; selv efter op til 10 år uden dyr, kan nye dyr erhverve smitten ved at græsse i folde, der tidligere har huset scrapie-får.
Smitte med scrapie er ikke blevet påvist i andre arter end får, geder og muffloner. I modsætning til dette kunne man i løbet af 1990’erne fastslå, at BSE med stor sandsynlighed er den hidtil eneste kendte TSE, som er zoonotisk, dvs. smittende fra dyr til mennesker. Det skyldtes, at der med nogle års forsinkelse (i forhold til den bovine epidemi) begyndte at opstå tilfælde af en ny slags spongiform encephalopati hos mennesker. Sygdommen har fået navnet »new variant« eller »variant« Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) for at understrege slægtsskabet med Creutzfeldt-Jakobs sygdom (CJD). CJD er den mest almindelige humane spongiforme encephalopati, og den har været kendt siden 1920’erne [2]. Den optræder hovedsageligt sporadisk og idiopatisk (dvs. med ukendt etiologi) med en ensartet geografisk spredning over hele verden og med en forekomst på omkring 1 tilfælde pr. 106 mennesker pr. år. CJD findes dog også i sjældnere forekommende arvelige former, og den er også beskrevet i en iatrogen (dvs. forårsaget af lægelig behandling) form. CJD er i sin iatrogene form en TSE, dvs. smittebåren.
Andre spongiforme encephalopatier er beskrevet i andre arter (tabel 1). De fleste betragtes som TSE’er, selv om der ikke er påvist overførbarhed i alle tilfælde. Et særligt dramatisk eksempel er kuru, som fandtes hos visse højlandsstammer på Ny Guinea, og som kunne sættes i forbindelse med rituel indtagelse af hjerner fra afdøde ved et begravelsesritual [3]. Kuru-epidemien er sandsynligvis opstået efter indtagelsen af hjernevæv fra et sporadisk CJD-tilfælde. I forbindelse med at ritualet blev forladt, er tilfældene næsten ophørt, men de opstår stadig, hvilket antyder, at inkubationstiden for denne TSE kan være mere end 40 år.
Disse sygdomme involverer med deres bemærkelsesværdige overførselsmåder og karakteristiske neuropatologi samt deres evne til både at opstå spontant, ved smitte og være arvelig en helt ny type sygdomsmekanisme. Mekanismen har som en central komponent et normalt værtsprotein, nemlig prionproteinet, PrPC [4,5].
Prionproteinet
Prionproteinet blev første gang påvist som en essentiel del af de proteinaflejringer, som sås i hjernen på hamstere, der var blevet indpodet med hjernemateriale fra scrapie-smittede får, og som efter en længere inkubationstid havde udviklet spongiform encephalopati [6]. Proteinaflejringerne er sammen med vakuolisering kendetegnende for spongiform encephalopati. De viste sig at være i stand til at overføre sygdommen og infektiviteten kunne spores til proteinet i udfældningerne. Det viste sig hurtigt at være et ganske usædvanligt protein, idet det opretholdt infektivitet selv efter behandling med bredspektrede proteaser (proteinnedbrydende enzymer), efter bestråling og efter autoklavering. Desuden var det stort set uopløseligt i normale solventer og kunne kun bringes i opløsning med stærkt denaturerende midler, f.eks. 1 M guanidiniumthiocyanat [7]. Da det samtidigt var (og er) umuligt at finde spor af nucleinsyrer i disse infektiøse partikler, var det af stor interesse at karakterisere dette protein.
Under ledelse af dr. Stan Prusiner lykkedes det efter en heroisk indsats en amerikansk forskergruppe med base i San Francisco at renfremstille nok af proteinet ud fra proteinaflejringer fra scrapie-indpodede hamsterhjerner til, at der kunne bestemmes en C-terminal aminosyresekvens på protease-behandlet PrPSc [8]. Det viste sig efterfølgende, at proteinet fra de kendetegnende og infektiøse proteinaflejringer, højst overraskende, var et hidtil ubeskrevet værtsprotein [9], som stammede fra et gen (PRNP) i værtens eget genom, hos mennesket på kromosom 20. Prusiner døbte proteinet »prion« som et anagram af en sammentrækning af »proteinaceous infectious particle« [6].
Endnu mere overraskende var det, da det viste sig, at prionproteinet blev udtrykt og fandtes i mange forskellige normale væv og celler hos raske individer i en form som sekvensmæssigt var identisk med det prionprotein, der var blevet fundet i de sygdomsassocierede proteinaflejringer i hjernen hos syge individer. Det var især overraskende, fordi det normale prionprotein (PrPC) opførte sig helt anderledes end det sygdomsassocierede og infektiøse prionprotein (PrPSc).
PrPC er et normalt, proteasesensitivt, vandopløseligt og ikke-patogent eller smitteoverførende membranprotein (tabel 2). Det har siden vist sig, at PrPC findes udtrykt som et GPI- (glycosylphosphatidylinositol-) forankret cellemembranprotein i mange forskellige typer af celler i den normale organisme, specielt i centralnervesystemets nerveceller. Det er et kobberbindende glycoprotein på 33-35 kDa, omkring 250 aminosyrer langt og med et varierende antal gentagne otte-aminosyre-mønstre (octarepeats) i den N-terminale del af molekylet og en transmembran-lignende, a-helix-agtig sekvens før den globulære del af molekylet. GPI findes på den C-terminale aminosyre og er typisk for løst associerede membranproteiner (figur 1).
Genet for prionproteinet er fundet hos et utal af arter lige fra svampe til mennesker. Sekvenser fra flere end 100 arter er nu deponeret i GenBank-databasen ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ), og sekvensen er meget konserveret, hvilket tyder på, at dette protein har en essentiel funktion. Nogen entydig funktion er dog endnu ikke blevet fastlagt.
»Protein-only«-hypotesen
Med et elegant, konceptuelt snuptag forenede Prusiner i 1982 de tilsyneladende modstridende data om PrPC og PrPSc i »protein-only«-hypotesen, som gjorde PrPC og PrPSc til centrale aktører i udviklingen og overførslen af de spongiforme encephalopatier (herefter »prionsygdomme«), uden medvirken af et traditionelt infektiøst agens (virus, bakterier, svampe, parasitter) [6]. Andre har tidligere fremsat lignende teorier for proteiners selv-replikation i disse sygdomme (tidligst [10]).
Hypotesen hævder, at PrPSc er en sjældent forekommende, patogen foldningstype af PrPC, og at PrPSc alene er ansvarlig for prionsygdommenes opståen og udvikling i et individ, der huser denne PrP-type. PrPC kan under passende (sjældne) betingelser omdannes til sin patogene isoform. Herved bliver forståelsen af betingelserne for konverteringen af PrPC til PrPSc afgørende for forståelsen af prionsygdommenes udvikling. Det centrale i hypotesen er, at den konformationelle omlejring fremmes ved interaktion mellem PrPSc og PrPC. I sjældne tilfælde kan en mutation i PrP-sekvensen destabilisere PrPC tilstrækkeligt til, at den spontant kan omlejre (sporadisk prionsygdom), eller der kan nedarves en særligt destabil sekvens (de familiære prionsygdomme). Endelig kan de overførbare prionsygdomme, TSE’erne, forklares ved, at exogent PrPSc kan introduceres via føden eller ad anden vej (f.eks. iatrogent) til de særligt sensitive nerveceller i centralnervesystemet, specielt i hjernen. I hjernen interagerer de med værtens eget PrPC, der omdannes til PrPSc, der så igen kan omdanne mere PrPC osv., hvorved der sættes gang i en trinvis og accelererende proces, der resulterer i proteinaflejringer, cellehenfald og slutteligt vakuolisering, som betinger prionsygdommenes sygdomsbillede (figur 2). PrPSc’s proteaseresistens er en integreret og vigtig del af sygdomsmekanismen. Den betinger ophobningen af de unedbrydelige proteinudfældninger, som anses for at være forudsætningen for udviklingen af de patologiske forandringer. Mens den strukturelle basis for PrPSc’s exceptionelle stabilitet er relativt dårligt belyst, er der efterhånden en del strukturel information, der understøtter PrPC’s omlejringstilbøjelighed, mekanismen bag omlejringen og til en vis grad, hvordan PrPSc kan fremme omlejringen (se nedenfor).
TSE-smitten er ikke »infektiøs« i traditionel forstand og medfører ikke noget immunrespons hos den smittede vært, (man kan dog fremstille antistoffer mod prionproteiner ved traditionel immunisering af f.eks. mus med oprenset prionprotein). Der ses heller ikke ændringer i biosyntesen af PrPC under udvikling af TSE. Det betyder, at man ikke kan diagnosticere disse sygdomme ud fra et bestemt respons hos det afficerede individ.
Nogle af de eksperimentelle fund, der i de senere år har understøttet hypotesen, er konstateringen af, at musestammer, der er »knock-out’ede« i PrP-genet (PrP0/0) ikke kan smittes med PrPSc [11], dvs. at udvikling af sygdom kræver, at værten selv udtrykker sit normale PrP. Det er endda vist, at hvis der indsættes et stykke hjernevæv fra en normal mus i hjernen på en PrP0/0-mus, vil der ved efterfølgende injektion af PrPSc i hjernen langsomt udvikle sig en spongiform encephalopati men kun i det normale, indsatte hjernevæv [11]. Det lader faktisk til, at man kan sætte lighedstegn mellem en celles niveau for udtrykkelse af PrPC og dens tilbøjelighed til at udvikle PrPSc-udfældninger.
Overførsel af PrPSc-struktur til PrPC er blevet påvist in vitro med gensplejsede former af prionproteinerne udtrykt i E. coli. Forsøgene viste, at hvis en bestemt genotype af PrPC har stor tilbøjelighed til at udvikle prionsygdom, f.eks. udtrykt ved korte inkubationstider efter eksperimentel indpodning af PrPSc vil denne type af PrPC også have relativt let ved at omlejre til PrPSc under påvirkning af det givne PrPSc in vitro [12,13]. I mennesker er der beskrevet hen ved 20 forskellige mutationer i PrPC, som medfører udviklingen af karakteristiske spongiforme encephalopatier. Det tyder på en meget direkte involvering af PrP. Aminosyre nr. 129 (hos mennesker enten methionin eller valin) har vist sig at have stor betydning for modtagelighed/inkubationstid og udvikling af neuropatologi/kliniske manifestationer hos mennesker. Alle vCJD-tilfælde er indtil videre optrådt hos mennesker, der er homozygote for methionin i position 129. Homozygoti ved denne position er i det hele taget en risikofaktor for udvikling af spongiforme lidelser [14].
Man bør være opmærksom på, at selv om »protein-only«-hypotesen understøttes af alle kendte eksperimentelle og kliniske data, er der stadig mange huller i vores forståelse af disse sygdomme. Det er f.eks. uklart, hvordan en specifik prionsygdoms fænotype kan opretholdes i en ny art, som det f.eks. er tilfældet med BSE og den afledte vCJD i mennesker, når det ifølge hypotesen er værtens eget prionprotein, der findes som PrPSc i de opståede proteinaflejringer, mens det exogent introducerede PrPSc kun udgør en minimal del af udfældningerne.
Det er også uklart, om sygdommene er en direkte følge af PrPSc-udfældninger, eller snarere skyldes mangel på PrPC, toxiske biprodukter eller beslaglæggelse af andre proteiner. Det er heller ikke kendt, hvordan de regionale læsioner (vakuoler og nervecelledød) egentlig opstår.
Det normale prionproteins struktur
Der er intet umiddelbart specielt ved prionproteinets struktur. Det er et ca. 35 kDa protein med to glycosyleringssites, en disulfidbro samt en C-terminal-glycophosphoinositol-gruppe. Sidstnævnte forankrer proteinet i cellens dobbelt-lipidmembran og benævnes et perifert membranprotein. I den N-terminale del findes nogle karakteristiske, gentagne otte-aminosyre mønstre, hvis antal varierer noget fra art til art, fulgt af en typisk transmembransekvens (figur 1). De to kulhydratgrupper er af den asparagin-bundne type, som kendes fra mange andre mammale glycoproteiner. Den primære sekvens er bemærkelsesværdig velbevaret fra art til art. Der er størst variation i de terminale dele af proteinet.
De første undersøgelser af dets rumlige struktur (ved circulær dichroisme (CD) og Fourier Transformations infrarød spektroskopi (FTIR)) viste, at a-helixer er den dominerende sekundære struktur i PrPC, mens b-sheet-strukturer dominerer i PrPSc. Det resultat førte til publiceringen af de første modeller for henholdsvis den normale og den patologiske foldning [15]. Modellen var baseret på neurale netværk, der forudsiger de sandsynlige kombinationer af de sekundære strukturelementer.
I 1996 lykkedes det eksperimentelt at fastslå den første rumlige struktur af det normale prionprotein ved NMR af et gensplejset museprionprotein [16]. Den eksperimentelt bestemte tertiære struktur afveg på flere punkter fra Prusiners teoretiske model [15]. Strukturen afveg ved at indeholde b-sheet-struktur, ved kun at indeholde 3 a-helixer og ved et andet arrangement af disse helixer, men hovedtrækkene var som forudsagt, dvs. overvejende »a-helical« (figur 3). Mere bemærkelsesværdigt var det, at de N-terminale ca. 120 aminosyrer (inklusive octa-repeat regionen) ikke dannede en rumligt defineret struktur, hvorfor det kun er proteinet fra position ca. 120 til 230, der danner en egentligt veldefineret, rumlig struktur – et såkaldt globulært domæne. Prionproteinet består altså af en ustruktureret N-terminal del og en globulær del i de ca. 60% af resten af molekylet med strukturen b1a1b2a2a3 (figur 1). Kulhydratdelene findes begge på a2. Den kobberbindende del af molekylet findes i den uordnede N-terminale del. Foruden strukturen af murint PrPC er strukturerne af hamster-, humant- og ko-PrPC i forskellige forkortede, gensplejsede udgaver blevet bestemt ved NMR, og de viser alle samme principielle struktur som muse-PrPC (figur 1 og 3). Dog har human- og hamster-PrPC en lang a2-helix, mens den er kort hos mus og loop’en mellem b2 og a2 er lang og fleksibel hos mus og menneske, mens den i hamsterproteinet er kort og strukturelt veldefineret.
Strukturen af den patogene udgave af prionproteinet (PrPSC) er ikke bestemt, men alt tyder på, at den afgørende forskel på de to strukturer er et større indhold af b-strands i PrPSc end i PrPC .
Det patologiske prionproteins struktur
Det er ikke lykkedes at bestemme den tertiære struktur af det patologiske prionprotein (PrPSc) eksperimentelt. Den må adskille sig væsentligt fra strukturen af det normale prionprotein, for at forklare den stærkt forøgede protease-resistens og tendensen til aggregering og udfældning i fibril-lignende strukturer. Samtidig skal en sådan struktur kunne opstå ud fra den samme primære sekvens; den primære sekvens skal med andre ord kunne eksistere i to forskellige foldninger.
En række eksperimentelle fund har bidraget til at belyse strukturen og har ført til en model, der til en vis grad forklarer dette paradoks. Et paradoks, der har stor betydning for forståelsen af proteinfoldning som en entydig funktion af aminosyresekvens eller, i sin yderste konsekvens, som en entydig funktion af den pågældende gensekvens.
Hornemann et al. publicerede i 1997 [17] en model baseret på bindingsstedet for det hidtil eneste rapporterede antistof, det er lykkedes at gøre specifikt for PrPSc. Bindingsstedet blev kortlagt ved at studere binding af antistoffet til overlappende syntetiske peptider, der dækkede det bovine PrPC’s sekvens. Det viste sig, at dette specielle antistof reagerede med et bindingssted, der var opbygget af områder fra tre adskilte regioner af aminosyrekæden, som var blevet bragt sammen i PrPSc .
Ifølge modellen er strukturen af PrPSc b1b2b3b4a2a3, dvs. a1 er blevet erstattet af b2b3, der sammen med de to andre b-stands udgør et velstabiliseret 4-strand b-sheet – altså en mere kompakt struktur med et højere indhold af b-sheets. Modellen passer godt med, at områder, der er defineret ved mutationer, har væsentlig betydning for PrPC’s evne til at blive omdannet til PrPSc. Områderne indgår i de smittede dele af proteinet (figur 4).
Modeller for omdannelse af PrPC til PrPSc
En række grundlæggende observationer belyser betingelser for omdannelse af PrPC til PrPSc:
PrPC kræver kontakt med PrPSc, før det kan omdannes til PrPSc. PrPSc stabiliseres i kompleks med andre PrPSc, hvilket fører til protease-resistente, udfældede aggregater af PrPSc [18]. PrPSc der stabiliseres særligt er ikke i stand til at fremme omdannelsen af PrPC til PrPSc . Denne egenskab ved PrPSc kræver en vis konformationel destabilisering [19]. Delvist udfoldede syntetiske peptider kan fremme omdannelsen, men det kan tilsvarende peptider i b-sheet ikke [18]. Helix 1, der er helt usædvanlig hydrofil, og som udelukkende stabiliseres af saltbroer, kan gennem en energetisk favorabel intermolekylær interaktion danne saltbroer med andre helix 1’ere under dannelsen af b-strand bundles. De holdes sammen af intermolekylære saltbroer, hvormed hydrofobe dele fra andre steder i molekylet føres sammen og danner det egentlige aggregat [20]. Et sådant hydrofobt sted kunne være segment 118-133 [21].
En form for PrP med et forøget indhold af b-sheet (PrPbeta) kan fremstilles eksperimentelt ud fra rekombinant PrPC. Rekombinant PrPC giver i sin grundform et stærkt aromatisk signal ved CD-spektroskopi – et tegn på, at sidekæderne i molekylet er pakket optimalt [22]. PrPbeta er karakteriseret ved forøget indhold af b-sheets og en dårligere pakning af sidekæder [22], hvilket er en såkaldt »molten globule«-struktur [23]. Dette betyder, at PrPbeta befinder sig i en quasistabil tilstand, som enten kan revertere til PrPC-strukturen eller kan føre til en irreversibel dannelse af en mere stabil struktur (PrPSc) ved interaktion med PrPSc. Dette understøttes af, at der, når der udskiftes aminosyrer, der svarer til mutationer, der fremmer dannelsen af PrPSc ud fra PrPC [24], ikke kan påvises nogen øget tendens til b-strand-dannelse i PrPC. Ifølge denne model er foldningen i PrPC derfor styret af den optimale pakning (docking) af sidekæder [22] og ikke af den enkelte sekvens’ tilbøjelighed til a-, henholdsvis b-strand-dannelse. Derimod styres foldningen i PrPSc eller i hvert fald i PrPbeta af aminosyrekædens sekundære konformationstilbøjeligheder i højere grad, i PrPbeta altså på bekostning af sidekædepakningen. Mutationer, der ses ved familiære prionsygdomme, kunne derfor tænkes at virke ved at forstyrre sidekæde-pakningen i PrPC og dermed løsne strukturen, som derved nemmere overgår til den propensity-kontrollerede PrPbeta-form. Disse mutationer har derimod ingen effekt på den lokale propensity i et fragment [24]. Sådanne mutationer i gensplejset PrPC er direkte vist at medføre destabilisering af strukturen.
PrPSc-formen tænkes i denne model (figur 5 øverst) at opstå ved TSE’er, når PrPbeta-former stabiliseres yderligere ved binding til eksisterende (introducerede) PrPSc og i arvelige TSE’er ved at den opståede mutation har så stor effekt, at PrPSc-foldningen opstår af sig selv og derefter yderligere skaber ny PrPSc ved stabilisering af PrPbeta-former til PrPSc-former. De PrPbeta-former, der er en forudsætning for PrPSc i denne model, tænkes at opstå under den naturlige PrPC-recykling i cellens endosomer, men vil ikke under normale omstændigheder, dvs. i fravær af PrPSc omdannes til PrPSc-formen.
En anden model (figur 5 nederst) postulerer, at PrPSc virker som katalysator for omdannelsen, enten under medvirken af PrPSc som monomer eller som multimer, men der er ikke beskrevet nogen overbevisende mekanisme for denne model.
In vivo kunne en række andre faktorer tænkes at have indflydelse på processen, især udtrykkelsesniveauet for PrPC samt andre »chaperone«-lignende proteiner (protein X [5]). Desuden vil der være en effekt af, at PrPC er et membranprotein, således at omlejringsprocesserne foregår i tæt forbindelse med disse membraner [25].
Konklusion
Prionproteinets evne til at folde i to væsentligt forskellige strukturer er afgørende for dets dramatiske skift i patogent potentiale. Det er et fascinerende eksempel på en ny type molekylær sygdomsmekanisme, og er grundlaget for identifikation af smitte med prionsygdomme, f.eks. BSE.
En bedre forståelse af foldningsmekanismerne og foldnings- og kompleksdannelsernes sammenhæng med udvikling af sygdom er af væsentlig betydning for udvikling af bedre diagnostiske metoder, der vil muliggøre detektion af smitte mere sikkert og på et tidligere tidspunkt i forhold til sygdomsudvikling. En sådan metode vil ideelt også tillade identifikation af typen af smitte, f.eks. mulig subklinisk smitte med BSE i får.
Der er derfor i 2001 startet et forskningsprojekt inden for dette område på Statens Veterinære Serumlaboratorium, som er Danmarks nationale overvågningslaboratorium for BSE. Projektet har som formål at udvikle følsomme diagnostiske metoder til detektion af BSE på prøvemateriale, der kan indsamles før aflivning og til detektion af BSE tidligere i inkubationsperioden.
Referencer
1. Wells, G.A.H., A.C. Scott, C.T. Johnson, R.F. Cunning, R.D. Hancock, M. Jeffret, M. Dawson, and R. Bradley. 1987. A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. Vet Rec 121:419.
2. Prusiner, S.B., J. Collinge, J. Powell, and B. Anderton. 1992. Prion Diseases of Humans and Animals. Ellis Horwood Limited, Chichester, West Sussex, UK,
3. Gajdusek, D.C. and V. Zigas. 1975. Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea – the endemic occurrence of »kuru« in the native population. N Engl J Med 257:974.
4. Prusiner, S.B. 1996. Molecular biology and genetics of prion diseases. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 61:473.
5. Prusiner, S.B. 1998. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A 95:13363.
6. Prusiner, S.B. 1982. Novel proteinaceous particles cause scrapie. Science 216:136.
7. Oesch, B., M. Jensen, P. Nilsson, and J. Fogh. 1994. Properties of the scrapie prion protein: quantitative analysis of protease resistance. Biochemistry 33:5926.
8. Prusiner, S.B., D.F. Groth, D.C. Bolton, S.B. Kent, and L.E. Hood. 1984. Purification and structural properties of a major scrapie prion protein. Cell 38:127.
9. Oesch, B., D. Westaway, M. Walchli, M.P. McKinley, S.B. Kent, R. Aebersold, R.A. Barry, P. Empst, D.B. Eplow, L.E. Hood, S.B. Prusiner, and C. Weissmann. 1985. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell 40:735.
10. Griffith, J.S. 1967. Self-replication and scrapie. Nature 215:1043.
11. Blattler, T., S. Brandner, A.J. Raeber, M.A. Klein, T. Voigtlander, C. Weissmann, and A. Aguzzi. 1997. PrP-expressing tissue required for transfer of scrapie infectivity from spleen to brain. Nature 389:69.
12. Raymond, G.J., J. Hope, D.A. Kocisko, S.A. Priola, L.D. Raymond, A. Bossers, J. Ironside, R.G. Will, S.G. Chen, R.B. Petersen, P. Gambetti, R. Rubenstein, M.A. Smits, P.T.J. Lansbury, and B. Caughey. 1997. Molecular assessment of the potential transmissibilities of BSE and scrapie to humans [see comments]. Nature 388:285.
13. Safar, J., H. Wille, V. Itri, D. Groth, H. Serban, M. Torchia, F.E. Cohen, and S.B. Prusiner. 1998. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations [see comments]. Nat Med 4:1157.
14. Ironside, J.W., K. Sutherland, J.E. Bell, L. McCardle, C. Barrie, K. Estebeiro, M. Zeidler, and R.G. Will. 1996. A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease: neuropathological and clinical features. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 61:523.
15. Huang, Z., S.B. Prusiner, and F.E. Cohen. 1995. Scrapie prions: a three-dimensional model of an infectious fragment. Fold Des 1:13.
16. Riek, R., S. Hornemann, G. Wider, M. Billeter, R. Glockshuber, and K. Wuthrich. 1996. NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-321). Nature 382:180.
17. Hornemann, S., C. Korth, B. Oesch, R. Riek, G. Wider, K. Wuthrich, and R. Glockshuber. 1997. Recombinant full-length murine prion protein, mPrP(23-231): purification and spectroscopic characterization. FEBS Lett 413:277.
18. Kaneko, K., H. Wille, I. Mehlhorn, H. Zhang, H. Ball, F.E. Cohen, M.A. Baldwin, and S.B. Prusiner. 1997. Molecular properties of complexes formed between the prion protein and synthetic peptides. J Mol Biol 270:574.
19. Caspi, S., M. Halimi, A. Yanai, S.B. Sasson, A. Taraboulos, and R. Gabizon. 1998. The anti-prion activity of Congo red. Putative mechanism. J Biol Chem 273:3484.
20. Morrissey, M.P. and E.I. Shakhnovich. 1999. Evidence for the role of PrP(C) helix 1 in the hydrophilic seeding of prion aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A 96:11293.
21. Come, J.H., P.E. Fraser, and P.T.J. Lansbury. 1993. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proc Natl Acad Sci U S A 90:5959.
22. Jackson, G.S., L.L. Hosszu, A. Power, A.F. Hill, J. Kenney, H. Saibil, C.J. Craven, J.P. Waltho, A.R. Clarke, and J. Collinge. 1999. Reversible conversion of monomeric human prion protein between native and fibrilogenic conformations. Science 283:1935.
23. Titsyn, O.B. 1995. Molten globule and protein folding. Adv.Protein Chem. 47:83.
24. Thompson, A.J. 2001. Title. Biochim Biophys Acta 1544:242.
25. Warwicker, J. 1999. Modelling charge interactions in the prion protein: predictions for pathogenesis. FEBS Lett 450:144.
26. Zahn, R., A. Liu, T. Luhrs, R. Riek, C. von Schroetter, G.F. Lopez, M. Billeter, L. Calzolai, G. Wider, and K. Wuthrich. 2000. NMR solution structure of the human prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A 97:145.
27. Krogsrud.J., P. Hopp, B. Bratberg, and M.J. Ulvund. 2000. Prionsjukdommer – en generel introduksjon. Norsk Vet.Tidsskrift 112:321.
28. Kretzschmar, H., L.E. Stowring, D. Westaway, W.H. Stubblebine, S.B. Prusiner, and S.J. DeArmond. 1986. Molecular cloning of human prion protein cDNA. DNA 5:315.
Nomenklaturboks
PrpC: Det normale, cellulære prionprotein (normale konformation).
PrPSc: Det protease- og varmeresistente prionprotein som det findes i prioner.
PrP*: En teoretisk form af prionproteinet, der er »infektivt«, men ikke nødvendigvis proteaseresistent.
PrPRES: En proteaseresistent form af prionproteinet, ikke nødvendigvis »infektivt«.
PrPbeta: En eksperimentelt opnåelig form af PrPC karakteriseret ved »molten globule«- og beta-sheet karakter samt en vis proteaseresistens og en vis infektivitet.
PrP 27-30: Den proteaseresistente kerne af PrPSc
Prion: Af »proteinaceous infectious particle« (Prusiner 1982), den infektiøse partikel der ses associeret med scrapie (eller anden TSE) »infektivitet«. Akkumulerer i hjernen ved disse sygdomme, men ses ikke altid som amyloide plaques.
Figur 1. Det humane prionprotein. Øverst en skematisk fremstilling af rækkefølgen af de kendte sekundære strukturelementer i den globulære del af proteinet, samt placeringen af kulhydrat, disulfidbro og GPI- (glycosylphosphatidylinositol) anker. Derunder et Kyte & Doolittle hydropati-plot, hvor positive værdier indikerer hydrofobe områder og negative indikerer hydrofile områder. De områder (propeptider, grå kasser) der fraspaltes under proteinets processering i det endoplasmatiske reticulum (1-22 og 231-253) udviser den typiske hydrofobe signatur; desuden genkendes octarepeats i mønstret mellem 53 og 85. Den globulære del af proteinet, for hvilken strukturen har kunnet bestemmes (ca. 120-230), udgør ca. 60% af det mature protein, mens resten er den strukturelt uordnede N-terminale del (23-ca. 120). Placeringen af a-helixer og b-strands er angivet med de grønne kasser, mens den transmembranære a-helicale sekvens er angivet med en blå kasse [28].
Figur 2. Skematisk oversigt over sammenhængen mellem prionproteinets struktur og udviklingen af TSE-patologi. PrPC går over en række hypotetiske trin (1-3) – ikke nødvendigvis i den viste rækkefølge – til sluttilstanden PrP*, hvilket fører til udfældning af prionprotein aggregater (plaques) bestående af den proteaseresistente isoform PrPSc og herfra i et eller flere trin (4) til dannelse af de spongiforme forandringer. I diagnostisk sammenhæng er den infektiøse/patogene form (PrP*) den interessante.
Figur 3. NMR-bestemte strukturer af det globulære domæne af PrPC fra tre forskellige arter. C-terminal er angivet med gult, N-terminal med blåt. Disulfid, kulhydrat og GPI er ikke angivet. Som det ses er strukturerne i det store hele ens (se detaljer i teksten).
Figur 4. Strukturen* af det globulære domæne af humant PrPC (til venstre) sammenlignet med Korth et al.’s model for strukturen af PrPSc (til højre) set fra en vinkel, der tydeligt viser påvirkningen af helix 1 ved den konformationelle omlejring. Områder med høj mobilitet er farvet røde og M129 er farvet lyseblå. N-terminal er blå, C-terminal er gul. Kulhydrat sidder på de to asparaginer hvis sidekæder er angivet. S-S bro er angivet ved stiplet rød linie.
*Repræsentativ NMR-struktur af humant prionprotein fragment (121-230) fra rekombinant E. coli. Strukturen omfatter 125-228 (1QML, [26])
Figur 5. Template- og seed-model for PrPSc-assisteret omdannelse af PrPC til PrPSc. Som det ses indebærer begge modeller mulighed for kædereaktionslignende forløb, i den øverste model (termodynamisk kontrol) tænkes omdannelsen at foregå på en voksende »krystal« af aggregeret PrPSc som proportionalt med sin størrelse er i stand til at omdanne stadigt mere PrPC, mens der i den nederste model (kinetisk kontrol) ved interaktion med PrPSc produceres to PrPSc-molekyler ud fra et molekyle PrPC, og begge disse molekyler kan gå tilbage og påvirke nye PrPC molekyler. Dette kan sammenlignes med en enzymatisk reaktion (reaktionen fremmes ved at aktiveringsenergien sænkes (katalyse)), mens den foregående model kan sammenlignes med en udfældnings/krystalliseringsreaktion involverende et ustabilt PrP-intermediat (PrPb) og et stærkt stabiliseret slutprodukt (se teksten).
Tabel 1. Et udvalg af transmissible spongiforme encephalopatier [27].
Tabel 2. Egenskaber af de to strukturelle isoformer af prionproteinet.
