Glutaminsyre er hjernens vigtigste stimulerende signalstof, men det er også involveret ved kramper. Det åbner mulighed for at bruge stoffer, der hæmmer glutaminsyres virkning til nye krampestillende midler.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 6/7, 2002 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Ulf Madsen, og Hans Bräuner-Osborne, Institut for Medicinalkemi, DFH
Glutaminsyre er en af hjernens vigtigste neurotransmittere, som påvirker stort set alle nerveceller i hjernen. Glutaminsyre udøver en eksitatorisk effekt på nervecellerne ved binding til glutaminsyrereceptorer på overfladen af nervecellerne. En tilstrækkelig stimulering af glutaminsyre receptorerne er af afgørende betydning for, at hjernen fungerer normalt.
Imidlertid kan forhøjede koncentrationer af glutaminsyre medføre kramper og udbredt nervecelledød, hvilket blandt andet ses under og efter epileptiske anfald. Stoffer, som kan hæmme en sådan hyperaktivitet af glutaminsyre, er derfor af interesse som nye antikonvulsive midler til behandling af epilepsi.
Glutaminsyre påvirker et stort antal forskellige subtyper af receptorer. Overordnet findes der to hovedtyper: de ionotrope receptorer og de metabotrope receptorer (figur 1). De ionotrope receptorer for glutaminsyre formidler hurtige signaler ved flux af natrium og calcium gennem ionkanaler. De metabotrope receptorer er G-proteinkoblede receptorer, som påvirker nervecellernes indhold af sekundære signalstoffer, hvilket frembringer langsommere effekter i nervecellerne. Såvel de ionotrope som de metabotrope receptorer er opdelt i tre undergrupper, der hver især er opdelt i et antal undertyper (figur 1).
Der er tidligere udviklet stoffer, som er meget effektive til at hæmme de ionotrope receptorer. I dyreforsøg har sådanne stoffer vist sig at være særdeles virksomme mod kramper, men desværre har de også haft alvorlige bivirkninger. Bivirkningerne skyldes netop stoffernes effektive blokade af receptorerne, der som nævnt har afgørende betydning for hjernens normale funktioner.
Pga. bivirkningerne ved blokade af de ionotrope receptorer er fokus nu i høj grad flyttet til de metabotrope receptorer. Disse receptorer modulerer nervecellernes aktivitetsniveau, og pga. deres langsommere signalveje kan de repræsentere en mildere måde at påvirke glutaminsyresystemet på.
Målet er at finde nye effektive stoffer, der kan hæmme de metabotrope receptorer, og bruge disse stoffer til at opklare hvilke undertyper af receptorerne, som er vigtige i forbindelse med bl.a. epilepsikramper. På den baggrund kan det blive muligt at skræddersy lægemidler, som kun påvirker netop de rigtige receptorer, og som derfor ikke vil medføre alvorlige bivirkninger.
Naturstof som leadstruktur
I jagten på midler med hæmmende effekt på glutaminsyrereceptorerne har stoffet ibotensyre (figur 2) spillet en afgørende rolle for forskningen i den neuromedicinalkemiske gruppe på Institut for Medicinalkemi, DFH. Ibotensyre er et naturstof fra rød fluesvamp, og fluesvampens giftighed skyldes blandt andet indholdet af ibotensyre.
Ibotensyre har potent stimulerende effekt på flere typer glutaminsyrereceptorer, både blandt de ionotrope og de metabotrope receptorer. Ibotensyre er en strukturanalog til glutaminsyre, hvor den distale syregruppe i glutaminsyre er erstattet med en 3-hydroxyisoxazol. Hydroxyisoxazolen har en pKa-værdi på ca. 5 og fungerer som en bioisoster1 til den distale syregruppe i glutaminsyre. Denne bioisoster er blevet brugt som leadstruktur ved syntesen af en række nye forbindelser, og disse stoffer har vist sig at have meget forskellige effekter på de forskellige typer af receptorer for glutaminsyre. Forbindelser med selektiv virkning på såvel de tre ionotrope som på de tre metabotrope receptorgrupper er blevet udviklet med ibotensyre som modelstof.
Stoffet homoibotensyre (HIBO, figur 2), som er en homolog til ibotensyre, har stimulerende effekt på en af de ionotrope receptorer (AMPA-receptorerne), men har også vist sig at kunne hæmme de metabotrope receptorer i Gruppe I. Da vi kun ønsker den ene af virkningerne, nemlig hæmningen af de metabotrope receptorer, har vi fremstillet en række nye stoffer ud fra HIBO. En serie HIBO-analoger med alkylkæder i 4-stillingen på isoxazolringen omfattende bl.a. sidekæder med 4-8 kulstofatomer blev syntetiseret ud fra b-ketoesteren 1 (figur 3). Efter alkylering med de respektive alkylbromider førte en ringslutning med hydroxyl-amin til de ønskede 3-hydroxyisoxazoler (3a-e). Efter beskyttelse af 3-hydroxygruppen ved alkylering med ethylbromid blev 5-methylgruppen bromeret ved omsætning med ren brom. Efterfølgende alkylering med dimethylacet-aminomalonester førte til de beskyttede former 6a-e af slutprodukterne. Afsluttende afbeskyttelse af 3-hydroxygruppen, spaltning af estergrupperne og amidgruppen samt decarboxylering forløb i koncentreret brombrinte i vand, hvorefter slutprodukterne 7a-e kunne isoleres som zwitterioner.
Denne syntesevej gav de 4-substituerede HIBO-analoger som racemater. Efterfølgende er flere af disse blevet resolveret i de enantiomere former med chirale HPLC-metoder. Fastlæggelse af den absolutte konfiguration for de opnåede R- og S-former er bl.a. blevet bestemt vha. røntgenkrystallografisk analyse (figur 4).
Ændret receptorselektivitet
De fremstillede forbindelser er karakteriseret farmakologisk på de forskellige typer af glutaminsyrereceptorer (figur 5). Med stigende kædelængde falder den uønskede aktivitet på de ionotrope glutaminsyrereceptorer (på AMPA-receptorerne, figur 1). Stoffet Hexyl-HIBO (7c) er således helt uden effekt på AMPA-receptorerne, i modsætning til Butyl-HIBO (7a) og Pentyl-HIBO (7b), som har henholdvis moderat og svag AMPA-receptoraktivitet. Effekten på de metabotrope receptorer er stort set uændret for Butyl-, Pentyl- og Hexyl-HIBO, som alle udviser hæmmende effekt på Gruppe I metabotrope receptorer (bestående af mGluR1 og mGluR5). Heptyl-HIBO (7d) er bemærkelsesværdig, fordi effekten på mGluR5 stort set er forsvundet, således at Heptyl-HIBO er en meget selektiv mGluR1-antagonist. For Octyl-HIBOs (7e) vedkommende er også effekten på mGluR1 forsvundet. Octyl-HIBO er derfor helt inaktiv på såvel de ionotrope som på de metabotrope receptorer.
Modvirker kramper i mus
En del af de fremstillede forbindelser blev efterfølgende testet på mus i en krampemodel. Forbindelsen Butyl-HIBO (7a) udviste konvulsiv effekt, hvilket tilskrives den AMPA-stimulerende effekt. Hexyl-HIBO (7c) udviste derimod krampestillende effekt over for inducerede kramper, mens Heptyl-HIBO (7d) var uden antikonvulsiv effekt. Forsøgene indikerer, at den antikonvulsive effekt af Hexyl-HIBO skyldes virkningen på mGluR5, hvorimod den selektive effekt af Heptyl-HIBO på mGluR1 er uden virkning over for inducerede kramper.
De gennemførte dyreforsøg blev dels udført ved indgift i blodbanen på mus og dels ved direkte indsprøjtning i hjernen. Kun ved den direkte indgift i hjernen blev de beskrevne effekter opnået. Forsøgene tyder derfor på, at de undersøgte forbindelser ikke kan trænge over blod-hjerne-barrieren og dermed komme fra blodet og ind i hjernen. En anden mulig forklaring kan være, at stofferne nedbrydes i blodet eller i leveren, inden de kan passere blod-hjerne-barrieren.
Den fortsatte forskning er derfor koncentreret om nye forbindelser med den ønskede hæmmende effekt på de metabotrope receptorer i Gruppe I, herunder udvikling af stoffer med selektiv effekt på mGluR5. Vi satser især på at udvikle analoger, som kan forbedre stoffernes evne til at trænge over blod-hjerne-barrieren og/eller forhindre nedbrydning af stofferne i blodbanen og leveren.
Fodnote
1) En bioisosterforbindelse er et stof fremkommet ved udbytning af et atom eller en gruppe af atomer med et andet eller andre tilsvarende atomer. Formålet med bioisostererstatning er at skabe et nyt stof med biologiske egenskaber svarende til udgangsstoffet. Bioisosteri kan være baseret på fysisk-kemiske egenskaber og/eller topologisk baseret.
Kilder
U.Madsen, H.Bräuner-Osborne, K.Frydenvang, L.Hvene, T.N.Johansen, B.Nielsen, C.Sánchez, T.B.Stensbøl, F.Bischoff and P.Krogsgaard-Larsen, Synthesis and pharmacology of 3-isoxazolol amino acids as selective antagonists at group I metabotropic glutamic acid receptors, J. Med. Chem. 44 (2001) 1051-1059.
T.N.Johansen, B.Ebert, H.Bräuner-Osborne, M.Didriksen, I.T.Christensen, K.K.Søby, U.Madsen, P.Krogsgaard-Larsen and L.Brehm, Excitatory amino acid receptor ligands: Resolution, absolute stereochemistry, and enantiopharmacology of 2-amino-3-(4-butyl-3-hydroxyisoxazol-5-yl)propionic acid, J. Med. Chem. 41 (1998) 930-939.
I.T.Christensen, B.Ebert, U.Madsen, B.Nielsen, L.Brehm and P.Krogsgaard-Larsen, Excitatory amino acid receptor ligands. Synthesis and biological activity of 3-isoxazolol amino acids structurally related to homoibotenic acid, J. Med. Chem. 35 (1992) 3512-3519.
Figur 1. Skematisk oversigt over hjernens glutaminsyrereceptorer. Klassifikationen omfatter de to hovedtyper, ionotrope og metabotrope receptorer, der hver især er opdelt i tre undergrupper, som yderligere er opdelt i et antal undertyper. Af de i alt 23 undertyper er der for overskuelighedens skyld kun angivet navne på de to Gruppe I-undertyper, som er relevante for dette projekt. Den grønne farve markerer den antikonvulsive effekt, som kan opnås ved hæmning af Gruppe I-receptorerne, hvorimod stimulering af AMPA-receptorerne har konvulsiv effekt (angivet med rød farve).
2. Kemisk struktur for neurotransmitteren glutaminsyre fra hjernen, naturstoffet ibotensyre fra den røde fluesvamp og for den syntetiske analog homoibotensyre (HIBO).
3. Syntese af HIBO-analogerne 7a-e.
Reagenser: (i) CH3ONa/CH3OH, alkylbromid; (ii) NH2OH; (iii) NaH, ethylbromid; (iv) Br2/AcOH; (v) NaH/(H3COOC)2-CH-NHCOCH3; (vi) 48% HBr.
4. Perspektivtegning af (R)-Hexyl-HIBO fra en røntgenkrystallografisk analyse.
5. Kemisk struktur af de fem HIBO-analoger (7a-e) der indeholder uforgrenede sidekæder (R) med 4-8 kulstofatomer. Stoffernes biologiske aktivitet er angivet i kvalitative termer.
