PET-radiokemi forener på fascinerende vis organisk, analytisk, medicinal og nuklear kemi. Her beskrives produktionen af sporstoffer, der er mærket med O-15, N-13 og F-18.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 10, 2003 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af Svend Borup Jensen, PET-centret, Århus Kommunehospital
PET-centret på Århus Kommunehospital er et billeddiagnostisk center, hvor man vha. Positron-Emissions-Tomografi (PET) undersøger kroppens stofskifte og forskellige receptorsystemer.
Der er i de sidste 10 år sket en voldsom udvikling af brugen af radioaktivitet i behandling og ikke mindst i diagnosticering af mange forskellige sygdomme. Denne udvikling er afhængig af de fremskridt, der har fundet sted inden for en lang række meget forskellige faggrupper. Elektronikkens, edb’ens og fysikkens verden har bl.a. bidraget med bedre radioaktivitetsdetektorer og computerne kan håndtere meget store mængder af informationer samtidig med, at man har fået pålidelige metoder til at producere en lang række ustabile isotoper. Læger og humanbiologer har bidraget med en større viden om kroppens opbygning og dens funktioner. Dvs. man i dag har en større forståelse for, hvorfor radioaktiviteten udbredes forskelligt i kroppen, og hvorfor der kan være forskel i radioaktivitetens udbredelse i en rask krop ift. en syg krop. Kemien og radiokemien har bidraget med metoder til at inkorporere forskellige radioaktive isotoper i mange forskellige stoffer.
PET-radiokemi på Århus Kommunehospital
PET-radiokemi skiller sig ud fra anden kemi ved, at der arbejdes med radioaktive isotoper, som har meget korte halveringstider. De korte halveringstider dikterer, hvad man kan, og i særdeleshed hvad man ikke kan. Man er tvunget til at benytte synteser og oprensningsmetoder, der forløber meget hurtigt, og som kan automatiseres. Vi kan typisk klare en syntese plus oprensning på mellem 5 minutter og 2 timer.
PET-centret er i princippet en lægemiddelvirksomhed. Dvs. at sporstofferne fremstilles under lægemiddeltilsynets opsyn og kontrol. Det stiller mange krav til både produktionen og kvalitetskontrollen af det, vi producerer. For at kunne honorere disse krav inden for kort tid kræves det, at planlægningen og vurderingen, af hvor lang tid de forskellige procedurer tager, går op i en højere enhed.
Man udbyder mere end 60 forskellige sporstoffer ved PET-centret i Århus, og man kan ofte med ret kort tidsfrist overtale en af kemikerne til at teste et nyt interessant sporstof.
Der findes så mange forskellige sporstoffer, fordi de kan bruges til at belyse forskellige biologiske processer.
Som PET-kemiker er det nødvendigt at have en del teknisk indsigt i computerstyring af de kemiske synteser, idet sporstofproduktionerne foregår bag tykke blyafskærmninger vha. computerstyrede ventiler og robotarme (billede 1).
PET-centret på kommunehospitalet råder over et lille, men rimeligt godt udstyret radiokemilaboratorium, hvor vi til stadighed forsøger at holde vores udstyr »up to date«. Vi er kemisk set i stand til at udføre stort set alle kendte mærkninger inden for PET-radiokemi.
I kvalitetslaboratoriet testes identiteten af sporstoffet samt mængden af urenheder, for at sikre at det lever op til de af Lægemiddelstyrelsen afstukne regler. På nuværende tidspunkt bruges GC og HPLC til disse analyser, men vi forventer, at vi på længere sigt vil inddrage andre analysemetoder som f.eks. NMR og LC-MS.
Den mængde sporstof, man injicerer, svinger en del, men ligger i området fra 10-6 til 10-15 mol, dvs. der er tale om meget små mængder.
En PET-radiokemikers arbejdsopgaver
I størstedelen af PET-centrets levetid har der været ansat fire kemikere i kemienheden. Disse fire kemikere har med hjælp fra bioanalytikere forestået produktionen af de radioaktive sporstoffer, kvalitetskontrollen af disse samt i nogle tilfælde også stofskifteanalysen. Stofskifteanalysen består i løbende at analysere blodprøver vha. HPLC.
Det er også kemikernes opgave at sørge for, at kemidelen af PET-centret lever op til loven. Det betyder, at alt skal dokumenteres, så Lægemiddelstyrelsen kan godkende det.
Kemienheden har syntetiseret tæt ved 18.000 sporstoffer gennem de sidste 10 år. Langt de fleste har været rutinesporstofferne vand, ammoniak og FDG, men der har også været mange andre. Ud over rutinesporstoffer er der syntetiseret over 100 forskellige sporstoffer, hvoraf knap halvdelen har været nye, dvs. at de ikke har været lavet andre steder før.
Ilt-15
Ilt (15O) fremstilles ved at beskyde nitrogen-14 med deuteriumioner (artikel 1). Ilt har en halveringstid på kun to minutter, så det sætter visse grænser for, hvad man kan nå at producere. Cyklotronen producerer 15O-16O, der – efter at have passeret QC – gives direkte til patienter for at se oxygenforbruget forskellige steder i kroppen.
Vand (H215O) laves ved at tilføre hydrogen til oxygen, der kommer i en strøm af nitrogen. Man producerer vanddamp ved at lade blandingen løbe igennem en platiniumkatalysator ved 380°C. Dampen fanges ved at lade den boble igennem en saltvandsopløsning, der så kan bruges til injektion. Vand bruges til at undersøge blodgennemstrømning.
Carbonmonooxid (C15O) og carbondioxid (C15O2) produceres ved at lade gasblandingen løbe igennem aktivt kul. Det udnyttes, at der ved lav temperatur (ca. 400°C) fortrinsvis produceres CO2, mens der ved høj temperatur (ca. 900°C) fortrinsvis produceres CO.
Man fjerner CO2 fra CO ved at lade gasblandingen løbe igennem ascarit (natriumhydroxidbelagt silica). Man fjerner CO’en fra CO2’en ved at lade gasblandingen boble igennem en opløsning. Carbonmonoxiden (C15O) bruges til at bestemme blodvolumen. Carbondioxiden (C15O2) til blod pH-målinger.
Nitrogen-13
Nitrogen-13 har en halveringstid på 10 minutter. Inden for radioagronomi har man brugt nitrat direkte fra cyklotronen til at mærke planter med. Inden for normale PET-undersøgelser har man, mig bekendt, kun mærket ammoniak og aminosyre med nitrogen-13.
For nogle år siden eksperimenterede nogle forskere med at mærke aminosyre med nitrogen-13. De lavede forskellige N-13-mærkede aminosyrer vha. enzymatiske reaktioner. Pga. dårligt udbytte af synteserne og aminosyrernes langsomme biokinetik slog det dog aldrig rigtigt an. Optagelsen var for langsom ift. en halveringstid på 10 minutter.
Man fremstiller ammoniak ved at lede den vandige blanding af nitrit og nitrat, som cyklotronen leverer, ind i et reagensglas, hvor man har Devardas legering (50% Cu, 45% Al og 5% Zn) og NaOH. Herved reduceres NOx- til NH3. Der udvikles varme under reduktionen, og man bobler helium igennem blandingen, så ammoniakken føres via heliumet til en anden beholder, hvor den fanges, ved at gassen bobles igennem en saltvandsopløsning. Ammoniakken bruges til at undersøge blodgennemstrømning af f.eks. et hjerte.
Fluor-18
Den – i PET-sammenhænge – lange halveringstid på 110 minutter gør, at man med fluor har større mulighed for at lave mere sofistikerede kemiske reaktioner. Der findes PET-centre, der hovedsagelig arbejder med at lave fluor-18-mærkede sporstoffer. I Århus forsker vi dog primært i kulstof-11-mærkede sporstoffer, men vi har alligevel en del fluormærkede sporstoffer som f.eks. F-DOPA, fluorid F-, F-b-alanin, F-MISO og FDG (figur 1).
F-DOPA’en bruges til at inspicere dopaminsyntesen, der foregår i hjernen.
Vha. fluorid F- kan man se på knoglerne/knoglevæksten (vores knogler er i en form for dynamisk ligevægt, hvor de hele tiden nedbrydes og opbygges).
Man kan observere proteinsyntesen og transporten af aminosyre ved brug af sporstoffet F-b-alanin.
F-MISO kan bruges til at se på kræft, da det er en hypoximarkør (mange kræftceller er hypoxiske, dvs. at de »mangler« ilt).
FDG er langt det mest kommercielle sporstof, der findes inden for PET. Det skyldes, at det bruges til at anskueliggøre glucosemetabolismen. Dvs. at man med FDG undersøger, hvor i kroppen der bruges energi i form af sukker.
FDG gennemgås som et eksempel på en nukleofil substitution og F-DOPA som et eksempel på en elektrofil substitution.
FDG-syntese
Vi kan få leveret fluor som fluorid (F-) i en vandig opløsning fra cyklotronen. Fluoridet kan f.eks. bruges til ved nukleofil substitution at producere et meget vigtigt stof i PET-sammenhænge – nemlig [18F]-FDG (reaktionsskema 1). Fluoridet adskilles fra vandet ved at lade blandingen løbe igennem en minisøjle, der indeholder 4-(4-methylpiperidino)pyridin (4-MPP). Langt det meste af fluoridet holdes tilbage på søjlen. Hvis der er vandrester tilbage på søjlen, virker substitutionen ikke, derfor fjernes vandet ved at skylle efter med tør acetonitril. Næste skridt er en SN2-reaktion mellem 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-O-trifluoromethansulfonyl-O-D-mannopyranose (mannose) og fluorid. Det er en slags faststof-syntese, der foregår ved, at man lader mannose/acetonitril-opløsningen løbe langsomt igennem minisøjlen (4 minutter). Mannosen og fluoridet reagerer og danner den beskyttede 18F-FDG.
Det er vigtigt, at det er en SN2-reaktion, for derved får FDG’en den rigtige konfiguration. Beskyttelsesgrupperne fjernes ved hydrolyse, der enten kan være basisk eller sur. I vores gamle system bruges sur hydrolyse (1 N HCl/100°C/20 minutter), men i det nye system bruges en basisk hydrolyse. Den basiske hydrolyse går meget hurtigere, men man skal passe på, at der ikke sker en racemering. En anden fordel ved den nye metode er, at fluoridsubstitutionen foregår i opløsning, fluoridionerne bringes »i opløsning« vha. kryptofix (N(CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2)3N). Ved den nye FDG- syntesemetode kan man komme op på 70% udbytte, hvilket er vældig godt inden for PET-verdenen, hvor man normalt er godt tilfreds med 10% udbytte.
FDG’en oprenses vha. en »flash column«-oprensning. Renhedskravene til FDG er relativt strenge. Det skal eftervises, at vi er under grænseværdierne for en lang række stoffer og opløsningsmidler. Indholdet af 4-MPP (resinmateriale) i produktet undersøges, og det checkes, om der er rester af opløsningsmidler som f.eks. acetonitril, methanol eller dichlormethan tilbage i prøven. Det kontrolleres også, hvor godt hydrolysen er forløbet, dvs. om der er uhydrolyseret FDG eller mannose i prøven, hvilket er et udtryk for, at der er sket en racemering af FDG’en.
F-DOPA-syntesen
I stedet for at få leveret fluoren som F- kan den leveres som F2 i en neongasopløsning fra cyklotronen. Den bruger vi, når der skal laves elektrofil substitution som f.eks. under F-DOPA-syntesen. Første skridt, når man vil lave F-DOPA, er at omdanne F2 til noget lidt mindre reaktivt, der dog vil deltage i en elektrofil substitution. Man reagerer F2 med CH3COOK/2CH3COOH (reaktionsskema 2). Herved taber man desværre halvdelen af radioaktiviteten, idet halvdelen bliver til K18F. Den anden halvdel bliver til [18F]acetylhypoflurit (H3CCO218F), som reageres med F-DOPA-startmaterialet for at danne den beskyttede [18F]-DOPA-forbindelse. For at sørge for at substitutionen foregår udelukkende i 6-positionen og ikke også i 2- og 5-positonen (figur 2), er man nødt til at have en god udtrædende/leaving gruppe i 6-postionen som f.eks. –HgOCOCH3 eller –Sn(CH3)3. Beskyttelsesgrupperne fjernes ved at tilsætte (aq.) HI og opvarme opløsningen. Udbyttet af F-DOPA-syntesen ligger omkring 5%, og det er selvfølgelig ikke noget at skrive hjem om. Man taber halvdelen i først skridt som K18F, man taber noget ved henfald af F-18, og man taber resten i syntesen og afbeskyttelsen, samt når man overfører opløsningerne fra et sted til et andet, i reaktionsflasker samt på filtre og søjler.
Oprensningen sker i første omgang ved, at man fjerner kviksølvet og startmaterialet ved at lade opløsningen løbe igennem en natriumthiosulfatsøjle og efterfølgende en silicasøjle. Når man er sluppet af med kviksølvet og startmaterialet injiceres prøven på en HPLC, og man laver en semi-præparativ HPLC-oprensning af den. Kvalitetskontrollen af slutproduktet foregår vha. HPLC og GC, hvor man bl.a. undersøger for indhold af kviksølv, 18F-DOPA, 19F-DOPA, DOPA samt 6-OH-DOPA, der er nogle af biprodukterne fra syntesen.
Den næste og sidste artikel i denne serie på tre artikler bringes i Dansk Kemi nr. 11. Den handler om kulstof-11-mærkede forbindelser. En af de tre store »hot-celler«, som PET-centret råder over. Væggene i »hot-cellerne« består af 70 mm bly eller 140 mm blyglas.
Et kik ind i en af »hot-cellerne«, man ser bl.a. en dispenser, en rotorevaporator, UV- og radiodetektor og HPLC-søjlerne, selve HPLC-pumpen er uden for »hot-cellen«.
Figur 1. Forskellige fluor-18 sporstoffer.
Figur 2. F-DOPA.
Reaktionsskema 1. FDG-syntesen.
Reaktionsskema 2. F-DOPA-syntesen.
