Hvordan tester vi om et ikke-fordøjeligt kulhydrat kan klassificeres som præbiotika?
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 8, 2012 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder. Se relaterede artikler nederst på siden.
Af ph.d. Louise Kristine Vigsnæs, postdoc, DTU Fødevareinstituttet og ph.d. Tine Rask Licht, professor, DTU Fødevareinstituttet
Siden begyndelsen af sidste århundrede er det blevet klart, at der eksisterer et symbiotisk forhold mellem tarmens bakterier og deres vært, mennesket. Ubalance i bakteriesammensætningen kan derfor have konsekvenser for værtens helbred. Ikke-fordøjelige kulhydrater, specielt præbiotika (faktaboks 1), kan selektivt stimulere væksten af gavnlige tarmbakterier og derved forbedre tarmmiljøet. Hvis et ikke-fordøjeligt kulhydrat skal kunne klassificeres som et præbiotika, er det nødvendigt med adskillige in vitro- og in vivo-studier for at validere det præbiotiske potentiale for det givne ikke-fordøjelige kulhydrat.
Tarmens bakterier og deres fordøjelse af næringsstoffer
Menneskets tarmkanal bebos af op til 100 billioner (1014) bakterier, hvilket betyder, at der er 10 gange flere bakterier i tarmen end det totale antal af celler i menneskekroppen. Menneskets tarmmikrobiota er kompleks og består af mange forskellige bakteriepopulationer (figur 1). De lever i et gensidigt fordelagtigt forhold med deres vært, hvor de hjælper med at udvinde energi fra kostfibre, som menneskets egne fordøjelsesenzymer ikke er i stand til at nedbryde [1]. Når bakterierne nedbryder kostfibrene i tyktarmen, dannes der forskellige metabolitter. De primære metabolitter er kortkædede fedtsyrer (dvs. eddikesyre, propionsyre, smørsyre og mælkesyre). Kortkædede fedtsyrer anses for at have en gavnlig effekt på menneskets sundhed. Eksempelvis har eddikesyre og mælkesyre vist sig at kunne hæmme væksten af patogene bakterier, propionsyre kan hæmme dannelse af kolesterol i leveren og smørsyre kan fremme anti-inflammatorisk immunrespons [2,3] (tabel 1).
Modulering af bakteriekompositionen i tarmen vha. præbiotika
Det er vigtigt, at mennesket kan tolerere tilstedeværelsen af de mange bakterier, der bebor tarmen, og at immunsystemet ikke begynder at reagere unødvendigt på disse. En ubalance i tarmens mikrobiota med fremvækst af skadelige mikroorganismer kan hæmme tarmens normale funktioner. Der findes arter i tarmen som mælkesyrebakterierne Lactobacillus og Bifidobacterium, der, hvis man forøger antallet af dem i tarmens økosystem, har en positiv effekt på tarmen [1,4,5]. Fødevarekomponenter, som præbiotika, kan anvendes til at forbedre sammensætningen af tarmmikrobiotaen ved bl.a. selektivt at stimulere væksten af laktobaciller og bifidobakterier. Præbiotika er typisk kort- eller langkædede (evt. forgrenede) kulhydrater. De kan være opbygget af forskellige typer monomerer, men fælles for dem er, at monomererne er bundet sammen med bindinger, som ikke kan nedbrydes af kroppens fordøjelsesenzymer, men derimod metaboliseres og udnyttes af specifikke bakterier.
Validering af præbiotisk effekt
For at et ikke-fordøjeligt kulhydrat skal kunne klassificeres som præbiotika, er det vigtigt, at det kan leve op til specifikationerne i præbiotika-definitionen. Dvs., at det ikke må blive nedbrudt af mavesyre eller menneskets fordøjelsesenzymer, og at det kan stimulere væksten og/eller aktiviteten af gavnlige tarmbakterier. Forsøg skal derfor udføres både in vitro (i laboratoriet) og in vivo (i levende værter) for at validere det præbiotiske potentiale for et givet ikke-fordøjeligt kulhydrat. I dag er der kun en lille delmængde af ikke-fordøjelige kulhydrater, der efter adskillige valideringsforsøg er klassificeret som præbiotika. Disse er:
I) fruktaner, som kan være frukto-oligosakkarider eller inulin, der begge består af fruktose-monomerer, der er kædet sammen med 12 glykosidbindinger,
II) galakto-oligosakkarider, som består af galaktose-monomerer, der er kædet sammen med 16 glykosidbindinger og
III) laktulose, som er et disakkarid bestående af galaktose og fruktose bundet sammen med en 14 glykosidbinding [6] (tabel 2). Metoder til produktion af nye typer præbiotiske kandidater er i dag ved at blive nyudviklet. Specielle enzymatiske teknologier kan bl.a. anvendes, hvor kandidaterne produceres fra sukkerroe- eller kartoffelrester.
Typer af in vitro-fermenteringsmetoder
In vitro-metoder kan anvendes til første indikation af selektiv fermentering af præbiotiske kandidater. Disse metoder er hurtigere, billigere og mere etisk forsvarlige end in vivo-teknikker, men har begrænsninger, såsom mangel på vært-bakterieinteraktioner og absorptionsprocesser. Derfor kan in vitro-teknikker kun anvendes prædikativt og videre undersøgelser som dyreforsøg og/eller humane studier er nødvendige for at dokumentere gavnlig effekt.
Batch, semi-kontinuerlige og kontinuerlige systemer er de primære anvendte in vitro-modeller. Til disse modeller anvendes friske afføringsprøver som inocula til simulering af menneskets tarmmikrobiota.
Batch-modellen er den mest simple af de tre in vitro-metoder. Her anvendes enkle fermenteringsbeholdere, som enten kan være ikke-pH kontrollerede eller mere fysiologisk korrekt pH-kontrollerede. Anaerobe forhold bevares under inkuberingen ved brug af et anerobt kammer eller iltfrie fermenteringsbeholdere. I et batch-system fjernes fermenteringsprodukterne ikke, så en inkuberingstid over 24 timer er ikke anbefalelsesværdig, da høje koncentrationer af fermenteringsprodukter kan hæmme bakteriernes vækst [7].
Inden for semi-kontinuerlige og kontinuerlige in vitro-metoder findes de dynamiske in vitro-modeller. Disse modeller kører med flere fermenteringsbeholdere i serie, hvori tarmsystemets forskellige afsnit simuleres. Det er en fordel frem for batch-systemet, da effekten af en given præbiotisk kandidat kan måles gennem hele tarmsystemet. De dynamiske modeller er ligeledes pH- og temperaturkontrollerede, har til- og udstrømning af næring og mulighed for adskillige prøveudtag under hele inkuberingsforløbet. De to mest kendte dynamiske in vitro-modeller er Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem [8] (SHIME) og TNO gastro-Intestinal Model [9] (TIM).
Dyreforsøg og/eller humane studier
Som nævnt kan en fødevarekomponent ikke klassificeres som præbiotika uden dyreforsøg og/eller et veldesignet human studie. Da både dyreforsøg og humane studier er dyre og tidskrævende, kan de med fordel anvendes efter in vitro præ-screening af mulige præbiotiske kandidater. Dyreforsøg er meget anvendelige, da de kan udføres helt kontrolleret, så variation i kosten undgås. Test af præbiotiske kandidater i dyreforsøg kan enten foregå i raske dyr eller i dyr med den lidelse, man ønsker at forebygge med præbiotisk behandling (f.eks. patogen infektion, diabetes, blødende tarmbetændelse eller allergi). Hvis der anvendes en model med syge dyr, bedømmes den præbiotiske effekt af en kandidat ud fra dens evne til at hæmme sygdomsaktiviteten og ud fra hvilke tarmbakterier, der stimuleres. Kvantificering af tarmbakterier kan enten være ud fra afføringsprøver taget løbende og/eller fra forskellige tarmafsnit taget ved forsøgets afslutning. Det er velkendt, at bakteriesammensætningen ændrer sig ned gennem tarmen, det bedste billede opnås derfor ved at tage prøver fra flere forskellige dele af tarmen.
I humane studier kan der også anvendes raske eller syge forsøgspersoner. I et veldesignet human studie er det vigtigt, at der er nok forsøgspersoner. Effekten af præbiotika bedømmes som ved dyreforsøg ud fra sygdomsaktiviteten og ændringer i tarmbakterierne. I humane studier foretages undersøgelsen af tarmbakterierne ofte vha. afføringsprøver, men enkelte studier har også brugt tarmbiopsier [10]. Tabel 3 viser en oversigt over nogle af de studier, der er udført for at bevise præbiotisk effekt.
Fælles for de nævnte in vitro- og in vivo-metoder er undersøgelsen af fermenteringsegenskaber, hvor bakteriemetabolitter som kortkædede fedtsyrer kan måles vha. gaskromatografi, og bakteriekompositionen kan måles vha. molekylære mikrobiologiske metoder som sekventering, fluorescerende in situ-hybridisering eller kvantitativ PCR.
Louise Kristine Vigsnæs er finansieret af Center for Biologisk Produktion af Kostfibre og Præbiotika. Centeret er støttet af Det Strategiske Forskningsråds Programkomite for Fødevarer og Sundhed (FøSU), samt DTU, Danisco og Lyckeby Stärkelsen.
Faktaboks 1 – Definition på præbiotika
Præbiotika er en selektivt fermenteret fødevarekomponent, som giver specifikke ændringer i sammensætningen og/eller i aktiviteten af tarmens mikrobiota, og herved medfører gavnlig effekt på værtens sundhed.
Referencer
1. Vernazza, C. L., Rabiu, B. A. & Gibson, G. R. Human colonic microbiology and the role of dietary intervention: introduction to prebiotics. in Prebiotics: Development and Application; Gibson, G. R. & Rastall, R. A. (eds.); John Wiley & Sons, Ltd: Chichester,2006; pp. 1-28 .
2. Fooks, L. J. & Gibson, G. R. In vitro investigations of the effect of probiotics and prebiotics on selected human intestinal pathogens. FEMS. Microbiol. Ecol. 2002, 39, 67-75.
3. Tedelind, S., Westberg, F., Kjerrulf, M. & Vidal, A. Anti-inflammatory properties of the short-chain fatty acids acetate and propionate: A study with relevance to inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 2007, 13, 2826-2832.
4. Atarashi, K., Tanoue, T., Shima, T., Imaoka, A., Kuwahara, T., Momose, Y., Cheng, G. H. et al. Induction of Colonic Regulatory T Cells by Indigenous Clostridium Species. Science. 2011, 331, 337-341.
5. Endt, K., Stecher, B., Chaffron, S., Slack, E., Tchitchek, N., Benecke, A., Van Maele, L. et al. The Microbiota Mediates Pathogen Clearance from the Gut Lumen after Non-Typhoidal Salmonella Diarrhea. Plos Pathogens. 2010, 6, 1-18.
6. Crittenden, R. G. & Playne, M. J. Production, properties and applications of food-grade oligosaccharides. Trends in Food Science & Technology. 1996, 7, 353-361.
7. Coles, L. T., Moughan, P. J. & Darragh, A. J. In vitro digestion and fermentation methods, including gas production techniques, as applied to nutritive evaluation of foods in the hindgut of humans and other simple-stomached animals. Animal Feed Science and Technology. 2005, 123, 421-444.
8. Molly, K., Woestyne, M. V. & Verstraete, W. Development of A 5-Step Multichamber Reactor As A Simulation of the Human Intestinal Microbial Ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 1993, 39, 254-258.
9. Minekus, M., Smeets-Peeters, M., Bernalier, A., Marol-Bonnin, S., Havenaar, R., Marteau, P., Alric, M. et al. A computer-controlled system to simulate conditions of the large intestine with peristaltic mixing, water absorption and absorption of fermentation products. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 53, 108-114.
10. Lindsay, J. O., Whelan, K., Stagg, A. J., Gobin, P., Al-Hassi, H. O., Rayment, N., Kamm, M. A. et al. Clinical, microbiological, and immunological effects of fructo-oligosaccharide in patients with Crohn’s disease. Gut. 2006, 55, 348-355.
Figur 1. Mave-tarmsystemets forskellige afsnit og fordeling af bakteriepopulationer.
Tabel 1. Bakteriegrupper involveret i dannelsen af kortkædede fedtsyrer og fedtsyrernes effekt.
Tabel 2. Oversigt over de industrielle klassificerede præbiotika.
Tabel 3. Dyreforsøg og humane studier til at bevise præbiotisk effekt.
