Den medicinske behandling af leddegigt er forbundet med en række alvorlige bivirkninger. For at forbedre behandlingen arbejdes der derfor på at skabe ROS-følsomme prodrugs af MTX og AMT. Et arbejde, der har givet lovende resultater.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 5, 2018 og kan læses uden illustrationer, strukturer og ligninger herunder.
Af Nikolaj S. Andersen, Jorge Peiró Cadahía, Viola Previtali og Mads H. Clausen, Institut for Kemi, DTU
Leddegigt eller reumatoid artritis er en udbredt autoimmun sygdom, som rammer op mod 1% af befolkningen i vestlige lande. Sygdommen er primært kendetegnet ved kronisk ledbetændelse, der forårsager irreversibel destruktion af led og knogler, og er forbundet med tiltagende invalidering, systemiske komplikationer, tidlig død og socioøkonomiske udgifter [1,2]. På trods af intensiv forskning er årsagen til leddegigt endnu uklar, men lidelsen opstår ved, at kroppens eget immunforsvar fejlagtigt anser visse dele af leddene som værende fremmedartede. Immunforsvaret trænger derfor ind i leddene (primært de perifere), der hæver op og langsomt ødelægges indefra af immuncellerne. Den kroniske betændelsestilstand resulterer i smerte, nedsat bevægelighed og efterlader leddene forkrøblede i takt med, at brusk og knogle ødelægges, figur 1.
Leddegigt kan ikke helbredes og kræver derfor livslang symptomatisk behandling med såkaldte sygdomsmodificerende antireumatiske lægemidler. Methotrexat (MTX) har siden 1980’erne været det foretrukne lægemiddel i symptomlindrende behandling af leddegigt. MTX blev oprindeligt udviklet til behandling af kræft tilbage i 1940’erne som en mindre giftig videreudvikling af aminopterin (AMT) – et af de første stoffer til brug i kemoterapi nogensinde, figur 2 [3]. I dag benyttes MTX stadig i kemoterapi (1.000-5.000 mg/uge), men det har i små doser (5-25 mg/uge) også vist sig at have en positiv effekt på den kroniske ledinflammation hos leddegigtpatienter.
Desværre er behandlingen af leddegigt stadig utilfredsstillende for mange patienter. MTX er forbundet med en lang række fremtrædende bivirkninger, særligt gastrointestinale, og stoffets effekt varierer meget fra patient til patient. Dette bevirker, at næsten halvdelen af patienterne må stoppe behandlingen inden for de første tre år [4]. Nyere bio-logiske lægemidler har vist lovende resultater i kombination med MTX, men disse er ekstremt dyre og er forbundet med yderligere bivirkninger [5].
Strategi
En måde at forbedre behandlingen af leddegigt på, er at få MTX til selektivt at udøve sin effekt lokalt ude i de sygdomsramte led, figur 3. I teorien bør effekten af MTX dermed forøges, mens uønskede bivirkninger i resten af kroppen mindskes. Et kendetegn ved kronisk inflammation, som potentielt kan udnyttes til dette, er et forhøjet niveau af reaktive oxygenspecier (ROS), særligt hydrogenperoxid – H2O2. I raske celler udfører meget lave koncentrationer af ROS vigtige fysiologiske roller som signalformidling, forsvar og biosyntese [6,7], men under kronisk inflammation, som i leddegigt, kan mængden af ROS øges 100-fold op til 1,0 mM og være en yderligere skadelig faktor mod det raske væv [8,9].
For at forbedre behandling af leddegigt, har vi derfor arbejdet på at skabe ROS-følsomme prodrugs af MTX og AMT. Et prodrug er en inaktiv form af et lægemiddel, som først inde i kroppen aktiviseres enten kemisk eller enzymatisk til den aktive form [10]. Ved at maskere lægemidlet med en ROS-følsom gruppe, vil dette prodrug i teorien ingen effekt have i kroppen, før det kommer i kontakt med det sygdomsramte væv, hvor lægemidlet aktiveres af ROS.
Med udgangspunkt i to ROS-følsomme grupper: fenylborsyre [11] (blev oprindeligt udviklet med henblik på anvendelse i cancer) og thiazolidinon [12], blev der udviklet to MTX-prodrugs og et prodrug baseret på AMT-designet, figur 4. I figur 5 ses en illustration af aktiveringsmekanismen for de to ROS-følsomme grupper.
Syntese og test af prodrugs
Prodrug 3 blev syntetiseret direkte fra MTX i fire trin, skema 1. Prodrugs 4 og 5 blev begge syntetiseret fra mindre byggeblokke (hhv. skema 2 og skema 3).
I indledende studier viste alle stoffer god stabilitet både i vandig buffer (pH 7,4), simuleret mavesyrevæske, blodplasma og ved tilstedeværelse af oxidative leverenzymer. Allervigtigst kunne alle tre prodrugs også aktiveres selektivt ved tilsætning af H2O2 i sygdomsrelevante koncentrationer. Baseret på disse lovende indledende data blev stofferne taget videre til dyreforsøg med mus, hvor der findes en velafprøvet sygdomsmodel for leddegigt – kollagen type-II induceret artritis. I grupper af otte blev de gigtplagede mus over en 14 dages periode behandlet med henholdsvis MTX, AMT, fenylborsyre prodrugs 2 og 3, thiazolidinon prodrug 4 samt en blank kontrol. Effekten af behandlingerne blev vurderet på to parametre: 1) en sygdomsscore baseret på mængden af hævelse i fodled og 2) musenes kropsvægt. Sygdomsscoren giver en vurdering af lægemidlets effekt på lindring af inflammationen, mens ændring af kropsvægt kan betyde dårlige tolerancer af stoffet på grund af kraftige bivirkninger.
Resultaterne er vist i figur 6, og det ses, at alle tre prodrugs nedsætter sygdomsscoren signifikant. Prodrug 3 og 5 viser signifikant forbedring af musenes inflammation og virker sammenligneligt med det aktive stof MTX. Kigger man på udviklingen af kropsvægt virker de to prodrugs til at blive tolereret bedre end MTX hen mod slutningen af forsøget. Mus behandlet med et af disse to prodrugs udviser generelt en meget stabil kropsvægt, mens behandling med MTX medfører et vægttab halvvejs igennem forsøget.
Prodrug 4 viser også tilsvarende effektivitet som prodrug 3 og 5, men kan ikke sammenlignes med AMT, da denne behandling måtte stoppes tidligt grundet for højt tab af kropsvægt. Dette bevidner dog en langt mere sikker profil af denne prodrug-strategi sammenlignet med det rene aktive stof. Det understreger også, hvorfor det mindre toksiske MTX hurtigt erstattede AMT.
Konklusion og fremtidigt arbejde
Med håb om en forbedret behandling af leddegigt har vi udviklet en række prodrugs, der først aktiveres, når de ankommer til de sygdomsramte led. De indledende laboratorieforsøg viste lovende resultater for stoffernes stabilitet og selektive aktivering med H2O2. Stofferne blev derfor ført videre til dyreforsøg med mus, hvor de også har givet spændende resultater. Deres inflammationslindrende effekt var sammenlignelig med MTX, men analyse af musenes kropsvægt indikerer en bedre tolerance over for vores prodrugs. Dette var særligt tydeligt med AMT-prodrug 4, der udviste en langt bedre tolerance sammenlignet med AMT.
Vi arbejder fortsat på at optimere egenskaberne af de syntetiserede MTX-prodrugs. Her er der primært tale om at indføre strukturelle ændringer af de forskellige reaktive grupper, samt hvordan de er bundet til MTX. Hermed er det muligt at ændre, hvor hurtigt et prodrug aktiveres og dermed forhåbentlig finjustere lægemidlets stabilitet, aktivitet og toksicitet.
Derudover er der planer om at gentage museforsøgene ved forskellige doser. De viste resultater er for en enkelt dosis og for at finde den optimale dosis og dermed bedre påvise en forskel fra MTX, kræver det behandlinger ved forskellige doser. Endeligt planlægger vi også rotteforsøg for at sammenligne stoffernes egenskaber i forskellige dyremodeller.
Videre læsning
Peiró Cadahía, J.; Bondebjerg, J.; Hansen, C. A.; Previtali, V.; Hansen, A. E.; Andresen, T. L.; Clausen, M. H. Synthesis and Evaluation of Hydrogen Peroxide Sensitive Prodrugs of Methotrexate and Aminopterin for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. J. Med. Chem. 2018, 61, 3503–3515.
Andersen N.S.; Peiró Cadahía, J.; Previtali, V.; Bondebjerg, J.; Hansen, C.A.; Hansen, A.E.; Andresen, T.L.; Clausen, M.H. Methotrexate Prodrugs Sensitive to Reactive Oxygen Species for the Improved Treatment of Rheumatoid Arthritis. Eur. J. Med. Chem. 2018, in press.
Kilder
1. Smolen, J.S.; Aletaha, D.; McInnes, I.B. Rheumatoid Arthritis. Lancet 2016, 388, 2023-2038.
2. McInnes, I.B.; Schett, G. The Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. N. Engl. J. Med. 2011, 365, 2205-2219.
3. Huennekens, F.M. The Methotrexate Story: A Paradigm for Development of Cancer Chemotherapeutic Agents. Adv. Enzyme Regul. 1994, 34, 397-419.
4. Bannwarth, B.; Péhourcq, F.; Schaeverbeke, T.; Dehais, J. Clinical Pharmacokinetics of Low-Dose Pulse Methotrexate in Rheumatoid Arthritis. Clin. Pharmacokinet. 1996, 30, 194-210.
5. Weinblatt, M.E. Methotrexate in Rheumatoid Arthritis: A Quarter Century of Development. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 2013, 124, 16-25.
6. Stone, J.R.; Yang, S. Hydrogen Peroxide: A Signaling Messenger. Antioxid. Redox Signal. 2008, 8, 243-270.
7. Wittmann, C.; Chockley, P.; Singh, S.K.; Pase, L.; Lieschke, G.J.; Grabher, C. Hydrogen Peroxide in Inflammation: Messenger, Guide, and Assassin. Adv. Hematol. 2012, 2012, 1-6.
8. Wruck, C.J.; Fragoulis, A.; Gurzynski, A.; Brandenburg, L.-O.; Kan, Y.W.; Chan, K.; Hassenpflug, J.; Freitag-Wolf, S.; Varoga, D.; Lippross, S.; et al. Role of Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis: Insights from the Nrf2-Knockout Mice. Ann. Rheum. Dis. 2011, 70, 844-850.
9. Gustowski, M.; Kowalczyk, S. No Title. Acta Biochem. Pol. 2013, 1-16.
10. Rautio, J.; Kumpulainen, H.; Heimbach, T.; Oliyai, R.; Oh, D.; Järvinen, T.; Savolainen, J. Prodrugs: Design and Clinical Applications. Nat. Rev. Drug Discov. 2008, 7, 255-270.
11. Kuang, Y.; Balakrishnan, K.; Gandhi, V.; Peng, X. Hydrogen Peroxide Inducible DNA Cross-Linking Agents Targeted. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 19278-19281.
12. Perez, C.; Monserrat, J.-P.; Chen, Y.; Cohen, S.M. Exploring Hydrogen Peroxide Responsive Thiazolidinone-Based Prodrugs. Chem. Commun. 2015, 51, 7116-7119.
