Semikvantitativ bestemmelse af fedtsyrer i fødevarer med intern standard og GC-MS.
Artiklen har været bragt i Dansk Kemi nr. 3, 2026 og kan læses uden illustrationer, strukturer eller ligninger herunder
(læs originalartiklen her)
Af Daniel Halling Breiner, seniorspecialist, og Gudrun M. Jónsdóttir, konsulent, Teknologisk Institut
Sammensætningen af fedtsyrer i en given fødevare har betydning for både smag og holdbarhed. Derfor er det vigtigt, at analyseresultaterne afspejler den reelle mængde af hver fedtsyre i fødevaren og ikke blot dens relative andel af det samlede fedtsyreindhold.
Fedtkvalitetsanalyser af fødevarer er traditionelt blevet gennemført ved bestemmelse af smeltepunkt, iodtal og ved analyse af fedtsyresammensætningen. Ved sidstnævnte bestemmes de enkelte fedtsyrers relative andel typisk ved gaskromatografi koblet til massespektrometri (GC-MS). Metoderne er sårbare over for variationer i prøveforberedelse og instrumentrespons. For at forbedre metodens robusthed og præcision benyttes deutereret intern standard i GC-MS metoden. Den interne standard muliggør korrektion for analyttab og variation i injektionsvolumen, så den relative profil ændres til en semikvantitativ bestemmelse, hvor resultaterne rapporteres i intern standardækvivalenter. Forbedringen giver et mere stabilt og sammenligneligt mål for fedtsyreindholdet og er et afgørende fundament for den videre udvikling mod en fuldt kvantitativ metode.
Fra relativ profil til absolut mængde
Fedtsyrerne omdannes først til fedtsyremethylestere (FAME), som efterfølgende separeres på en GC-kolonne baseret på forskelle i kogepunkt og polaritet. Detektion sker typisk med en flammeioniseringsdetektor (FID) og et massespektrometer (MS), se figur 1.
En traditionel GC-analyse giver et kromatogram (figur 2), hvor arealet under hver top er proportionalt med mængden af den pågældende FAME. De enkelte fedtsyrers andel beregnes som en procentdel af det samlede areal af alle identificerede fedtsyretoppe. Metoden giver en fremragende fedtsyreprofil, der viser, om fødevaren primært indeholder palmitinsyre eller oliesyre, men den angiver ikke den absolutte koncentration af fedtsyrerne i den oprindelige prøve.
Dette skyldes, at mængden af ekstraheret fedt kan variere, og at små variationer i det injicerede volumen på GC’en kan påvirke det samlede signal. En prøve med 5 procent totalfedt og en prøve med 10 procent totalfedt kan i princippet give en identisk relativ fedtsyreprofil, selvom den faktiske mængde af hver fedtsyre (for eksempel i mg/100 g) er dobbelt så høj i sidstnævnte.
Metodisk tilgang og analyse
Fedtsyrer bestemmes som FAME ved GC-MS efter modificeret lipidekstraktion og methylering [1]. Den kemiske omdannelse af fedtsyrer til FAME foregår i laboratoriet ved en syrekatalyseret transesterificering med bortrifluorid-methanol (BF3-MeOH). Metodens pålidelighed hviler på to grundpiller: en veldokumenteret kromatografisk separation og en korrekt anvendelse af den interne standard.
Det er afgørende, at GC-MS kan adskille de mange forskellige fedtsyrer, der forekommer i en kompleks prøve. Metodens separationsevne er dokumenteret ved analyse af en certificeret standardblanding, som vist i figur 2. Kromatogrammet bekræfter, at de enkelte FAME, fra de kortkædede mættede til de langkædede flerumættede, opnår en god separation.
I figur 2 ses GC-MS kromatogrammet for en FAME-standardblanding. Denne indgår som reference for retentionstider og massespektre. Referencekørslen er en forudsætning for korrekt identifikation af fedtsyrer i ukendte fødevarer.
Kvantificeringen opnås ved at integrere den interne standard i prøveforberedelsen. En deutereret standard tilsættes før selve transesterificeringen. Ved at lade standarden følge prøven gennem alle oprensningstrin, fungerer den som en intern målestok.
Efter GC-MS analysen bestemmes koncentrationen af hver enkelt fedtsyre (mangler) ved at normalisere arealet for den pågældende fedtsyre (mangler) mod arealet for den interne standard (mangler). Resultatet beregnes ved hjælp af formlen:
(formel mangler)
hvor mangler er den tilsatte masse af intern standard i mg, og mangler er den afvejede prøvemasse i g.
Metoden udgør et markant fremskridt med hensyn til præcision og robusthed. I beregningerne ligger der dog en implicit antagelse om, at alle fedtsyre-metylestre giver samme detektorrespons som den interne standard ved en given koncentration. Dette svarer til at sætte deres indbyrdes responsfaktor til 1.
I praksis er dette en velaccepteret forenkling, men ikke fuldstændig korrekt. Forskellige FAME opfører sig forskelligt, når de analyseres ved GC-MS. Både ioniseringseffektiviteten i ionkilden og fragmenteringsmønsteret kan variere afhængigt af molekylets kædelængde og antallet af dobbeltbindinger. Den sande responsfaktor for en kort, mættet fedtsyre som C14:0 vil derfor typisk afvige fra responsfaktoren for en lang, flerumættet fedtsyre som C22:6.
Responsfaktorer er nøglen til nøjagtighed
Ved videreudvikling fra semikvantitativ til fuldt kvantitativ analyse skal de individuelle relative responsfaktorer (RRF) for hver enkelt fedtsyre bestemmes ved analyse af en standardblanding med kendte koncentrationer af både fedtsyrer (mangler) og den interne standard (mangler).
RRF for hver fedtsyre beregnes som:
(formel mangler)
hvor (mangler) og (mangler) er de målte peak-arealer.
Den relative responsfaktor bestemmes mest robust ved at fremstille en multipunkts-kalibreringskurve, hvor arealforholdet plottes som funktion af koncentrationsforholdet. Hældningen på linjen er per definition den relative responsfaktor. Kalibreringen giver både den nødvendige korrektionsfaktor og dokumenterer metodens linearitet for hver enkelt fedtsyre.
RRF er ikke en teoretisk konstant, men et praktisk, relativt mål, der er direkte afhængigt af den valgte interne standard. RRF-værdien beskriver, hvor kraftigt en analyt responderer i massespektrometeret i forhold til den interne standard. Ved skift af intern standard vil hele sættet af RRF-værdier for alle fedtsyrer ændre sig.
I udviklingen af metoden er myristinsyre-d27 (C14:0-d27) benyttet som intern standard. Undersøgelser viste, at de eksperimentelt bestemte RRF-værdier, selv for nært beslægtede fedtsyrer, afviger væsentligt fra den idealiserede værdi på 1,0. For eksempel blev RRF bestemt til 0,549 for palmitinsyre (C16:0) og 0,595 for stearinsyre (C18:0).
Dette illustrerer, hvorfor bestemmelsen af individuelle RRF-værdier er et absolut nødvendigt skridt i overgangen fra semikvantitative målinger til sande, nøjagtige koncentrationer. De specifikke RRF-værdier er naturligvis kun gyldige for netop denne kombination af analytter og standarden C14:0-d27.
Perspektiv. Fra sammensætning til kemisk holdbarhed
Den kvantitative fedtsyreanalyse muliggør kobling til andre analytiske data, såsom analyse af flygtige organiske forbindelser (VOC). Aldehyder som hexanal og ketoner er nedbrydningsprodukter fra polyumættede fedtsyrer og bidrager væsentligt til udviklingen af harsk smag. Ved at integrere den kvantitative fedtsyreprofil kan et produkts fedtsyresammensætning kobles til den sensoriske holdbarhed.
Visionen er at kunne besvare følgende spørgsmål:
• Hvor hurtigt udvikler et produkt med en given koncentration af linolensyre uacceptable niveauer af off-flavour-forbindelser?
• Kan fedtsyreprofilen anvendes som prædiktor for holdbarhed?
For mange fødevareprodukter er det den kemiske og ikke den mikrobiologiske holdbarhed, der er den begrænsende faktor [2]. En kvantitativ, kemisk tilgang til holdbarhed vil kunne give et mere objektivt beslutningsgrundlag for kvalitetsstyring og reducere unødvendigt madspild.
Acknowledgements
Tak til Svineafgiftsfonden samt Uddannelses- og Forskningsstyrelsen for finansiel støtte til metodeudvikling og -test.
Tak til Annemette Aufeldt for en velgennemført praktikopgave.
E-mail:
Daniel Halling Breiner: DBRE@teknologisk.dk
Gudrun M. Jónsdóttir: GMJR@teknologisk.dk
Referencer
1. Font-I-Furnols, M., Čandek-Potokar, M., Maltin, C., & Povše, M.P. (2015). Fatty acid analysis in meat and meat products. In A handbook of reference methods for meat quality assessment (1st ed., pp. 55-65). COST Action FA1102. http://www.cost.eu.
2. Skibsted, L.H., Risbo, J., & Andersen, M.L. (2010). Chemical Deterioration and Physical Instability of Food and Beverages (1st ed.). Woodhead Publishing.
